שיטת PCR טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה AAV ב- מורין רשתית
Summary
פרוטוקול זה מציג כיצד לכמת את יעילות התמרה של AAV ברשתית העכבר באמצעות PCR טיפה דיגיטלית (dd-PCR) יחד עם ייצור AAV בקנה מידה קטן, הזרקה תוך-ויטמינית, הדמיית רשתית ובידוד DNA גנומי ברשתית.
Abstract
מעבדות רבות לביולוגיה של תאי הרשתית משתמשות כיום באופן שגרתי בווירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) לעריכת גנים וליישומים רגולטוריים. היעילות של התמלת AAV היא בדרך כלל קריטית, אשר משפיע על התוצאות הניסיוניות הכוללות. אחד הגורמים העיקריים ליעילות התמרה הוא הסרוטיפ או הגרסה של וקטור AAV. נכון לעכשיו, סרוטיפים מלאכותיים שונים של AAV ווריאנטים זמינים עם זיקות שונות לארח קולטני פני תא. עבור טיפול גנטי ברשתית, התוצאה היא דרגות שונות של יעילות transduction עבור סוגי תאים רשתית שונים. בנוסף, מסלול ההזרקה ואיכות ייצור AAV עשויים להשפיע גם על יעילות התמסורת של רשתית AAV. לכן, חיוני להשוות את היעילות של גרסאות שונות, אצוות ומתודולוגיות שונות. שיטת ה-PCR (dd-PCR) של טיפה דיגיטלית כימתה את חומצות הגרעין בדיוק גבוה ומאפשרת ביצוע כימות מוחלט של יעד נתון ללא כל תקן או התייחסות. באמצעות dd-PCR, זה גם אפשרי להעריך את יעילות התמרה של AAVs על ידי כימות מוחלט של מספרי עותק הגנום AAV בתוך רשתית מוזרקת. כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לכמת את קצב התמרה של AAVs בתאי רשתית באמצעות dd-PCR. עם שינויים קלים, מתודולוגיה זו יכולה גם להיות הבסיס לכימות מספר העותק של DNA מיטוכונדריאלי, כמו גם הערכת היעילות של עריכת בסיס, קריטי עבור מספר מחלות רשתית ויישומים לטיפול בגנים.
Introduction
וירוסים הקשורים אדנו (AAVs) משמשים כיום עבור מגוון רחב של מחקרים ריפוי גנטי ברשתית. AAVs מספקים דרך בטוחה ויעילה של אספקת גנים עם פחות אימונוגניות ופחות שילובי גנום. כניסת AAV לתא היעד מתרחשת באמצעות אנדוציטוזיס, אשר דורש כריכה של קולטנים וקולטנים משותפים על פני השטח התא1,2. לכן, יעילות התמסורת של AAVs עבור סוגי תאים שונים תלויה בעיקר capsid ואת האינטראקציות שלה עם קולטני התא המארח. AAVs יש סרוטיפים וכל סרוטיפ יכול להיות טרופיזם תאי / רקמה ברור ויעילות transduction. ישנם גם סרוטיפים מלאכותיים של AAV ווריאנטים שנוצרו על ידי שינוי כימי של קפסיד הווירוס, ייצור של קפידים היברידיים, החדרת פפטיד, דשדוש קפסיד, אבולוציה מכוונת, mutagenesis רציונלי3. אפילו שינויים קלים ברצף חומצות אמינו או מבנה קפיד יכול להשפיע על אינטראקציות עם גורמי תא מארח וכתוצאה מכך tropisms שונים4. בנוסף וריאנטים capsid, גורמים אחרים כמו מסלול הזרקה וריאציה אצווה לאצווה של ייצור AAV יכול להשפיע על יעילות transduction של AAVs הרשתית העצבית. לכן, שיטות אמינות להשוואת שיעורי התמסורת עבור וריאנטים שונים נחוצים.
רוב השיטות לקביעת יעילות התמרה של AAV מסתמכות על ביטוי גנים עיתונאיים. אלה כוללים הדמיה פלואורסצנטית, אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי, או ניתוח היסטוכימי של מוצר הגן הכתב5,6,7. עם זאת, בשל אילוץ הגודל של AAVs, זה לא תמיד אפשרי לכלול גנים עיתונאי לפקח על יעילות transduction. באמצעות מקדמים חזקים כמו משפר CMV היברידי / עוף בטא-אטין או וודצ’אק הפטיטיס לאחר אלמנט רגולטורי לאחר שעתוק (WPRE) כרצף מייצב mRNA מסבך עוד יותר את בעיית הגודל8. לכן, זה יהיה גם מועיל להגדיר את שיעור התמולה של AAVs מוזרק עם מתודולוגיה ישירה יותר.
טיפה דיגיטלית PCR (dd-PCR) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לכמת DNA היעד מכמויות דקות של דגימות. טכנולוגיית dd-PCR תלויה אנקפסולציה של DNA היעד ותערובת תגובת PCR על ידי טיפות שמן. כל תגובת dd-PCR מכילה אלפי טיפות. כל טיפה מעובדת ומנותחת כתגובת PCR עצמאית9. ניתוח של טיפות מאפשר לחשב את מספר העותק המוחלט של מולקולות DNA היעד בכל דגימה פשוט באמצעות אלגוריתם פואסון. מכיוון שיעילות התמרה של ה- AAVs מתואמת עם מספר העותק של הגנום AAV ברשתית העצבית, השתמשנו בשיטת dd-PCR כדי לכמת גנומים AAV.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה dd-PCR כדי לחשב את יעילות התמרה של וקטורים AAV מ- DNA גנומי רשתית6,10. ראשית, AAVs המבטאים כתב tdTomato נוצרו באמצעות פרוטוקול בקנה מידה קטן, titered על ידי שיטת dd-PCR11. שנית, AAVs הוזרקו תוך-ויטארי לרשתית העצבית. כדי להדגים את יעילות התמרה, כימתנו תחילה את ביטוי tdTomato באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנת ImageJ. לאחר מכן בידוד ה- DNA הגנומי לכימות גנומים AAV ברשתיות מוזרקות באמצעות dd-PCR. השוואה של רמות הביטוי tdTomato עם הגנום AAV transduced כימות על ידי dd-PCR הראה כי שיטת dd-PCR כימתה במדויק את יעילות התמרה של וקטורים AAV. הפרוטוקולים שלנו הדגימו תיאור מפורט של מתודולוגיה מבוססת DD-PCR כדי לכמת את יעילות התמרה של AAV. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גם את המספר המוחלט של גנומים AAV המועברים לאחר זריקות תוך-ויטמיניות פשוט על ידי שימוש בגורם הדילול לאחר בידוד DNA גנומי ותוצאות dd-PCR. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה רבת עוצמה, אשר תהיה חלופה לביטוי עיתונאי לכמת את יעילות התמולה של וקטורים AAV ברשתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, יצרנו שני וקטורים AAV שיש להם חלבונים קפדיים שונים ולאחר מכן titered אותם בהתאם. אחד הצעדים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הוא לייצר כמויות מספיקות של AAVs שיניב ביטוי עיתונאי לגילוי לאחר התמרה12,13.
Titering של AAVs הוא גם גורם חשוב כדי להתאי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאוזקאן קיילס, ג’וזפין יוטנר ופרופ’ בוטנוד רוסקה, המכון לרפואת עיניים מולקולרית וקלינית באזל, פלטפורמת וירוסים מורכבים על עזרתם והתמיכה בייצור AAV. ברצוננו גם להודות לפרופ’ ז’אן בנט, בית הספר לרפואה פרלמן, אוניברסיטת פנסילבניה על זן AAV8/BP2. עבודות בעלי חיים מבוצעות במתקן בעלי החיים של האוניברסיטה הטכנית גבזה. על כך אנו מודים ליילה דיקמטס ופרופ’ אויגר חליס טזבאי על הסיוע הטכני והתמיכה בבעלי חיים. ברצוננו גם להודות לד”ר פאטמה אוזדמיר על הערותיה על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי TUBITAK, מספרי מענק 118C226 ו 121N275, ומענק שילוב אוניברסיטת סאבאנסי.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referencias
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
