הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי
Summary
השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.
Abstract
במצב יציב, תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) נשארים במידה רבה שקטים ומאמינים שהם מסתמכים בעיקר על גליקוליזה כדי לענות על הצרכים האנרגטיים שלהם. עם זאת, בתנאי עקה כגון זיהום או אובדן דם, HSCs מתרבים ומייצרים במהירות תאי אב במורד הזרם, אשר בתורם מתמיינים עוד יותר, ובסופו של דבר מייצרים תאי דם בוגרים. במהלך תהליך המעבר וההתמיינות הזה, HSCs יוצאים מ-quiescence ועוברים במהירות מעבר מטבולי מגליקוליזה לזרחון חמצוני (OxPHOS). מצבי עקה שונים, כגון הזדקנות, סרטן, סוכרת והשמנת יתר, יכולים להשפיע לרעה על תפקוד המיטוכונדריה ולכן יכולים לשנות את התכנות מחדש וההבחנה המטבולית של HSCs ואבות קדמונים במהלך hematopoiesis. תובנות חשובות על תפקודים גליקוליטיים ומיטוכונדריים של HSCs ואבות אבות בתנאים רגילים ובתנאים של לחץ ניתן להשיג באמצעות הערכת קצב ההחמצה החוץ-תאית שלהם (ECAR) וקצב צריכת החמצן (OCR), שהם אינדיקטורים לגליקוליזה תאית ולנשימה מיטוכונדריאלית, בהתאמה.
כאן, פרוטוקול מפורט מסופק למדידת ECAR ו- OCR באוכלוסיות תאים שליליות ממח עצם עכבר, הכוללות הן גזע המטופויאטי והן תאי אב פרימיטיביים (HSPCs), באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי. פרוטוקול זה מתאר גישות לבידוד תאים שליליים לשושלת ממח העצם של העכבר, מסביר אופטימיזציה של צפיפות זריעת תאים וריכוזים של 2-דאוקסי-D-גלוקוז (2-DG, אנלוגי גלוקוז המעכב גליקוליזה) ותרופות שונות ממוקדות OxPHOS (אוליגומיצין, FCCP, רוטנון ואנטימיצין A) המשמשות במבחנים אלה, ומתאר אסטרטגיות טיפול תרופתיות. ניתן למדוד פרמטרים מרכזיים של שטף גליקוליטי, כגון גליקוליזה, קיבולת גליקוליטית ורזרבה גליקוליטית, ופרמטרים של OxPHOS, כגון נשימה בסיסית, נשימה מקסימלית, דליפת פרוטונים, ייצור ATP, קיבולת נשימתית רזרבית ויעילות צימוד. פרוטוקול זה מאפשר מדידות ECAR ו- OCR על HSPCs שאינם דבקים וניתן להכליל אותו כדי למטב את תנאי הניתוח עבור כל סוג של תאי השעיה.
Introduction
Hematopoiesis הוא התהליך שבו סוגים שונים של תאי דם בוגרים עם פונקציות מיוחדות מאוד נוצרים מ HSCs1. HSCs מסוגלים להתחדשות עצמית והתמיינות לאוכלוסיות אבות רב-תכליתיות וספציפיות שונות. אבות אלה מייצרים בסופו של דבר תאים של שושלות לימפואידיות, מיאלואידיות, אריתרואידיות ומגקריוציטים. כדי לשמור על יכולת ההתחדשות העצמית שלהם, HSCs נשארים שקטים במידה רבה, וכמו תאי גזע אחרים ברקמות, מאמינים שהם מסתמכים על גליקוליזה ולא על OxPHOS מיטוכונדריאלי לייצור ATP 2,3. כניסה למחזור התאים מובילה לנשימה מוגברת ול-OxPHOS, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של מיני חמצן תגובתי (ROS), המזיקים לתחזוקת HSC ולתפקוד3. חלוקה חוזרת ונשנית של התאים עשויה אפוא להוביל לירידה ביכולת ההתחדשות העצמית של HSCs ובסופו של דבר לתשישותם.
בהמטופואיזיס בוגר, HSCs עוברים בעיקר חלוקת תאים אסימטרית, שבמהלכה אחד מתאי הבת שומר על פוטנציאל HSC וממשיך להסתמך על חילוף החומרים הגליקוליטי. תא הבת השני הופך לתא אב פרימיטיבי שמאבד את יכולת ההתחדשות העצמית אך מתרבה ובסופו של דבר יוצר תאים המטופויאטיים תפקודיים מתמיינים4. כאשר HSCs מתמיינים כדי לייצר אבות במורד הזרם, מעריכים כי מעבר מגליקוליזה לחילוף חומרים מיטוכונדריאלי מתרחש כדי לספק את האנרגיה ואבני הבניין הדרושות כדי לתמוך במעבר מהיר זה5, כפי שהוצע על ידי התצפיות כי HSCs הם בעלי מסה מיטוכונדריאלית לא פעילה 6,7,8,9 . לעומת זאת, פעילות מיטוכונדריאלית (המסומנת על ידי רמות ROS מקושרות) גבוהה בהרבה אצל אבות המחויבים לשושלת מאשר ב-HSCs 9,10,11. שינויים מטבוליים המתרחשים במהלך השלב המוקדם ביותר של hematopoiesis ולכן מציעים תפקיד ישיר וחיוני של המיטוכונדריה בוויסות גורל HSC.
מיטוכונדריה לא מתפקדת הקיימת בתנאי עקה שונים, כגון הזדקנות, סרטן, סוכרת והשמנת יתר12, עלולה להפריע ליכולת ההתחדשות העצמית של HSC, ולגרום לחוסר איזון בהתמיינות HSC/אבות על ידי ייצור כמויות מופרזות של ROS, פגיעה בייצור ATP ו/או על ידי שינוי תהליכים מטבוליים אחרים 9,12,13 . הפרעות בהומאוסטזיס מטבולי ב-HSC/התמיינות אבות עלולות להשפיע באופן משמעותי על ההמטופואיזיס, מה שעשוי לתרום להתפתחות הפרעות המטולוגיות13. בהתחשב בהשפעות הקריטיות של הגליקוליזה והמיטוכונדריאלית OxPHOS על גזע והבחנה של HSC, מעניין לחקור הן פרמטרים מטבוליים בתנאי שגרה והן בתנאי לחץ. ניתן לקבל תובנות חשובות על התפקוד הגליקוליטי והמיטוכונדריאלי של HSCs ותאי אב על ידי הערכת ה-ECAR וה-OCR שלהם, שהם אינדיקטורים לגליקוליזה תאית ולנשימה מיטוכונדריאלית, בהתאמה.
מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים הוא מנגנון רב עוצמה המצויד בשתי בדיקות לכל באר כדי למדוד בו זמנית ECAR ו- OCR בתאים חיים ולכן ניתן להשתמש בו כדי להעריך ביו-אנרגיה תאית בזמן אמת, בתגובה למצעים או מעכבים שונים. מחסנית הבדיקה המשמשת את המנתח מכילה יציאות הזרקה להחזקת עד ארבע תרופות להזרקה אוטומטית במהלך הבדיקה. סכימה של בדיקת מאמץ טיפוסית לגליקוליזה מוצגת באיור 1A. הבדיקה מתחילה במדידת ECAR של תאים, דגירה במדיום בדיקת מאמץ גליקוליזה המכיל גלוטמין אך לא גלוקוז או פירובט. הדבר מייצג החמצה המתרחשת עקב פעילות לא גליקוליטית של התאים ומדווחת כהחמצה לא גליקוליטית. זה ואחריו הזרקת גלוקוז בריכוז רווי. באמצעות גליקוליזה, גלוקוז בתא מומר לפירובט, אשר עובר מטבוליזם נוסף בציטופלסמה כדי לייצר לקטט, או במיטוכונדריה כדי לייצר CO2 ומים.
המרה של גלוקוז לקטט גורמת לייצור נטו ולשחרור נוסף של פרוטונים לתוך המדיום החוץ-תאי, וכתוצאה מכך לעלייה מהירה ב-ECAR 14,15,16. שינוי זה המעורר גלוקוז ב-ECAR מדווח כגליקוליזה בתנאים בסיסיים. הזריקה השנייה מורכבת מאוליגומיצין (מעכב של ATP סינתאז, א.ק.א. קומפלקס V17), המעכב ייצור ATP מיטוכונדריאלי. במהלך עיכוב OxPHOS בתיווך אוליגומיצין, התאים מווסתים את הגליקוליזה באופן מרבי כדי לענות על הדרישות האנרגטיות שלהם. זה גורם לעלייה נוספת ב- ECAR, וחושף את הקיבולת הגליקוליטית המרבית של התאים. ההבדל בין הקיבולת הגליקוליטית המרבית לבין הגליקוליזה הבסיסית מכונה עתודה גליקוליטית. לבסוף, 2-DG מוזרק, מה שגורם לירידה משמעותית ב- ECAR, בדרך כלל קרוב לרמות החמצה לא גליקוליטיות. 2-DG הוא אנלוגי לגלוקוז שנקשר באופן תחרותי להקסוקינאז, וכתוצאה מכך מעכב את הגליקוליזה18. לפיכך, הירידה המושרה על ידי 2-DG ב-ECAR מאשרת עוד יותר כי הגליקוליזה היא אכן המקור ל-ECAR שנצפה לאחר זריקות גלוקוז ואוליגומיצין.
איור 1B מציג את הסכימה עבור מבחן מאמץ מיטוכונדריאלי טיפוסי. הבדיקה מתחילה במדידת OCR בסיסית של התאים, תוך דגירה במדיום בדיקת דחק מיטוכונדריאלי המכיל גלוקוז, גלוטמין ופירובט. לאחר מדידות OCR בסיסיות, אוליגומיצין מוזרק במבחן זה, אשר מעכב V מורכב, ובכך מפחית את זרימת האלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC)17. כתוצאה מכך, OCR מופחת בתגובה להזרקת אוליגומיצין, וירידה זו ב- OCR קשורה לייצור ATP מיטוכונדריאלי. הזריקה השנייה מורכבת מקרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומתוקסי) פניל הידרזון (FCCP), פרוטונופור ובלתי מתמצא של OxPHOS17 מיטוכונדריאלי. FCCP מכווץ את שיפוע הפרוטונים המיטוכונדריאליים בכך שהוא מאפשר זרימה של פרוטונים על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדרית. בגלל הזרקת FCCP, זרימת האלקטרונים דרך ה- ETC היא derepressed, ו- IV מורכב צורך חמצן ברמה המקסימלית. ההבדל בין OCR מקסימלי לבין OCR בסיסי מכונה קיבולת הנשימה הרזרבית, שהיא מדד ליכולתו של התא להגיב לביקוש מוגבר לאנרגיה בתנאי עקה. לבסוף, מוזרקת תערובת של שני מעכבי ETC (רוטנון, מעכב I מורכב, ואנטימיצין A, מעכב IIIמורכב 17), מה שמכבה לחלוטין את זרימת האלקטרונים, ו- OCR יורד לרמה נמוכה. זיהוי תווים אופטי (OCR) שנמדד לאחר הזרקת רוטנון ואנטי-מיצין A מתאים ל-OCR שאינו מיטוכונדריאלי המונע על-ידי תהליכים אחרים בתוך התאים. זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי מאפשר חישוב של נשימה בסיסית, דליפת פרוטונים ונשימה מקסימלית.
נשימה בסיסית מייצגת את ההבדל בין זיהוי תווים אופטי (OCR) בסיסי לבין זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. דליפת פרוטון מתייחסת להבדל בין OCR לאחר הזרקת אוליגומיצין לבין זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. נשימה מקסימלית מייצגת את ההבדל בין OCR לאחר הזרקת FCCP לבין זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. יעילות הצימוד מחושבת כאחוז מקצב הייצור של ATP לשיעור הנשימה הבסיסי. מאמר שיטה זה מספק פרוטוקול מפורט למדידת ECAR ו- OCR ב- HSPCs שליליים לשושלת באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XFe96. פרוטוקול זה מתאר גישות לבידוד HSPCs שליליים לשושלת עכברים, מסביר את האופטימיזציה של צפיפות זריעת התאים וריכוזים של תרופות שונות המשמשות בבדיקות שטף חוץ-תאיות, ומתאר אסטרטגיות לטיפול תרופתי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר שיטה זה מתאר פרוטוקול ממוטב להערכת ביו-אנרגיה תאית (גליקוליזה ו-OxPHOS) ב-HSPCs של עכברים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים. מכשיר זה הוא כלי רב עוצמה המודד בו זמנית את ה- ECAR וה- OCR של תאים חיים, שהם מדדים של גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית, בהתאמה. לפיכך, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הביו-…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדת לומברד נתמכת על ידי NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 ו- ME200030), וקרן גלן למחקר רפואי. העבודה במעבדת לי נתמכת על ידי NIH (NHLBI 5R01HL150707).
Materials
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
Referencias
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
- Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
- Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).
- Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
