Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi
Summary
Burada sunulan yöntem, HSPC’lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC’ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.
Abstract
Kararlı durum altında, hematopoetik kök hücreler (HSC’ler) büyük ölçüde sessiz kalır ve enerjik ihtiyaçlarını karşılamak için ağırlıklı olarak glikolize bağımlı olduklarına inanılmaktadır. Bununla birlikte, enfeksiyon veya kan kaybı gibi stres koşulları altında, HSC’ler proliferatif hale gelir ve hızla aşağı akış progenitör hücreleri üretir, bu da daha da farklılaşır ve sonuçta olgun kan hücreleri üretir. Bu geçiş ve farklılaşma işlemi sırasında, HSC’ler sessizlikten çıkar ve hızla glikolizden oksidatif fosforilasyona (OxPHOS) metabolik bir geçişe uğrar. Yaşlanma, kanser, diyabet ve obezite gibi çeşitli stres koşulları, mitokondriyal fonksiyonu olumsuz yönde etkileyebilir ve böylece hematopoez sırasında HSC’lerin ve progenitörlerin metabolik yeniden programlamasını ve farklılaşmasını değiştirebilir. HSC’lerin ve progenitörlerin normal ve stres koşulları altında glikolitik ve mitokondriyal fonksiyonları hakkında değerli bilgiler, sırasıyla hücresel glikoliz ve mitokondriyal solunumun göstergeleri olan hücre dışı asitleşme hızlarının (ECAR) ve oksijen tüketim oranlarının (OCR) değerlendirilmesi yoluyla elde edilebilir.
Burada, hücre dışı akı analizörü kullanılarak hem hematopoetik kök hem de ilkel progenitör hücreleri (HSPC’ler) içeren fare kemik iliği kaynaklı soy-negatif hücre popülasyonlarında ECAR ve OCR’yi ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, soy-negatif hücreleri fare kemik iliğinden izole etme yaklaşımlarını açıklar, hücre tohumlama yoğunluğunun optimizasyonunu ve 2-deoksi-D-glikoz (2-DG, glikolizi inhibe eden bir glikoz analoğu) ve bu tahlillerde kullanılan çeşitli OxPHOS hedefli ilaçların (oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin A) konsantrasyonlarını açıklar ve ilaç tedavi stratejilerini açıklar. Bu testlerde glikoliz, glikolitik kapasite ve glikolitik rezerv gibi glikolitik akının anahtar parametreleri ve bazal solunum, maksimal solunum, proton sızıntısı, ATP üretimi, yedek solunum kapasitesi ve kuplajın verimliliği gibi OxPHOS parametreleri ölçülebilir. Bu protokol, yapışkan olmayan HSPC’lerde ECAR ve OCR ölçümlerine izin verir ve her türlü süspansiyon hücresi için analiz koşullarını optimize etmek üzere genelleştirilebilir.
Introduction
Hematopoez, HSC’lerden1’den son derece uzmanlaşmış fonksiyonlara sahip çeşitli olgun kan hücrelerinin oluşturulduğu süreçtir. HSC’ler kendini yenileme ve çeşitli multipotent ve soya özgü progenitör popülasyonlara farklılaşma yeteneğine sahiptir. Bu progenitörler nihayetinde lenfoid, miyeloid, eritroid ve megakaryosit soylarının hücrelerini üretir. Kendini yenileme kapasitelerini korumak için, HSC’ler büyük ölçüde sessiz kalır ve diğer doku kök hücreleri gibi, ATP üretimi için mitokondriyal OxPHOS yerine glikolize dayandığına inanılmaktadır 2,3. Hücre döngüsüne giriş, gelişmiş solunum ve OxPHOS’a yol açarak, HSC bakımı ve işlevi3’e zarar veren yüksek reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerine neden olur. Bu nedenle tekrarlanan hücre bölünmesi, HSC’lerin kendini yenileme kapasitesinin azalmasına ve nihayetinde tükenmelerine neden olabilir.
Erişkin hematopoezde, HSC’ler öncelikle asimetrik hücre bölünmesine uğrar, bu sırada yavru hücrelerden biri HSC potansiyelini korur ve glikolitik metabolizmaya güvenmeye devam eder. Diğer yavru hücre, kendini yenileme kapasitesini kaybeden ancak çoğalan ve sonunda farklılaşmış fonksiyonel hematopoetik hücrelere yol açan ilkel bir progenitör hücre haline gelir4. HSC’ler aşağı akış progenitörleri üretmek için farklılaştığında, HSC’lerin inaktif mitokondriyal kütleye sahip olduğu gözlemleriyle önerildiği gibi, bu hızlı geçişi desteklemek için gereken enerjiyi ve yapı taşlarını sağlamak için glikolizden mitokondriyal metabolizmaya geçişin gerçekleştiği düşünülmektedir5 6,7,8,9 . Buna karşılık, mitokondriyal aktivite (bağlı ROS seviyeleri ile gösterilir), soy bağlantılı progenitörlerde HSC’lerden 9,10,11’den çok daha yüksektir. Bu nedenle, hematopoezin en erken basamağında meydana gelen metabolik değişiklikler, HSC kaderinin düzenlenmesinde mitokondrinin doğrudan ve önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
Yaşlanma, kanser, diyabet ve obezite12 gibi çeşitli stres koşulları altında ortaya çıkan işlevsiz mitokondri, HSC’nin kendini yenileme kapasitesine müdahale edebilir, aşırı miktarda ROS üreterek, ATP üretimini bozarak ve / veya diğer metabolik süreçleri değiştirerek HSC / progenitör farklılaşmasında dengesizliğe neden olabilir 9,12,13 . HSC/progenitör farklılaşmasında metabolik homeostazdaki pertürbasyonlar hematopoezi önemli ölçüde etkileyerek hematolojik anormalliklerin gelişimine potansiyel olarak katkıda bulunabilir13. Glikoliz ve mitokondriyal OxPHOS’un HSC saplılığı ve farklılaşması üzerindeki kritik etkileri göz önüne alındığında, hem normal hem de stres koşulları altında metabolik parametrelerin araştırılması ilgi çekicidir. HSC’lerin ve progenitör hücrelerin glikolitik ve mitokondriyal fonksiyonlarına ilişkin değerli bilgiler, sırasıyla hücresel glikoliz ve mitokondriyal solunumun göstergeleri olan ECAR ve OCR’lerini değerlendirerek kazanılabilir.
Denizatı hücre dışı akı analizörü, canlı hücrelerde ECAR ve OCR’yi aynı anda ölçmek için kuyu başına iki prob ile donatılmış güçlü bir cihazdır ve bu nedenle çeşitli substratlara veya inhibitörlere yanıt olarak hücresel biyoenerjetik maddeleri gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Analizör ile birlikte kullanılan tahlil kartuşu, tahlil sırasında otomatik enjeksiyon için dört adede kadar ilacı tutacak enjeksiyon portları içerir. Tipik bir glikoliz stres testinin şeması Şekil 1A’da gösterilmiştir. Tahlil, glutamin içeren ancak glikoz veya piruvat içermeyen glikoliz stres test ortamında inkübe edilen hücrelerin ECAR’ının ölçülmesiyle başlar. Bu, hücrelerin glikolitik olmayan aktiviteleri nedeniyle meydana gelen asitleşmeyi temsil eder ve glikolitik olmayan asitleşme olarak rapor edilir. Bunu doygun bir konsantrasyonda glikoz enjeksiyonu izler. Glikoliz yoluyla, hücredeki glikoz, laktat üretmek için sitoplazmada veya CO2 ve su üretmek için mitokondride metabolize edilen piruvat’a dönüştürülür.
Glikozun laktata dönüştürülmesi, net üretime ve ardından protonların hücre dışı ortama salınmasına neden olur ve ECAR 14,15,16’da hızlı bir artışa neden olur. ECAR’daki bu glukoz uyarıcı değişiklik, bazal koşullar altında glikoliz olarak bildirilmektedir. İkinci enjeksiyon, mitokondriyal ATP üretimini inhibe eden oligomisin’den (ATP sentazının bir inhibitörü, diğer adıyla kompleks V17) oluşur. Oligomisin aracılı OxPHOS inhibisyonu sırasında, hücreler enerjik taleplerini karşılamak için glikolizi maksimum düzeyde düzenler. Bu, ECAR’da daha fazla artışa neden olur ve hücrelerin maksimum glikolitik kapasitesini ortaya çıkarır. Maksimum glikolitik kapasite ile bazal glikoliz arasındaki fark glikolitik rezerv olarak adlandırılır. Son olarak, ECAR’da genellikle glikolitik olmayan asitleşme seviyelerine yakın önemli bir düşüşe neden olan 2-DG enjekte edilir. 2-DG, hekzokinaz’a rekabetçi bir şekilde bağlanan ve glikoliz18’in inhibisyonu ile sonuçlanan bir glikoz analoğudur. Bu nedenle, ECAR’daki 2-DG kaynaklı azalma, glikolizin gerçekten glikoz ve oligomisin enjeksiyonlarından sonra gözlenen ECAR’ın kaynağı olduğunu doğrulamaktadır.
Şekil 1B , tipik bir mitokondriyal stres testinin şemasını göstermektedir. Tahlil, glikoz, glutamin ve piruvat içeren mitokondriyal stres test ortamında inkübe edilen hücrelerin temel OCR ölçümü ile başlar. Bazal OCR ölçümlerini takiben, oligomisin bu teste enjekte edilir, bu da kompleks V’yi inhibe eder, böylece elektron taşıma zinciri (ETC) boyunca elektron akışını azaltır17. Sonuç olarak, oligomisin enjeksiyonuna yanıt olarak OCR azalır ve OCR’deki bu azalma mitokondriyal ATP üretimi ile bağlantılıdır. İkinci enjeksiyon, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP), bir protonofor ve mitokondriyal OxPHOS17’nin bir unkuplöründen oluşur. FCCP, mitokondriyal iç zar boyunca protonların akışına izin vererek mitokondriyal proton gradyanını çökertir. FCCP enjeksiyonu nedeniyle, ETC’den elektron akışı bastırılır ve kompleks IV maksimum seviyede oksijen tüketir. Maksimum OCR ve bazal OCR arasındaki fark, hücrenin stres koşulları altında artan enerji talebine cevap verme yeteneğinin bir ölçüsü olan yedek solunum kapasitesi olarak adlandırılır. Son olarak, iki ETC inhibitörünün (rotenon, bir kompleks I inhibitörü ve antimisin A, bir kompleks III inhibitörü17) bir karışımı enjekte edilir, bu da elektron akışını tamamen kapatır ve OCR düşük bir seviyeye düşer. Rotenon ve antimisin A enjeksiyonundan sonra ölçülen OCR, hücrelerin içindeki diğer işlemler tarafından yönlendirilen mitokondriyal olmayan OCR’ye karşılık gelir. Mitokondriyal olmayan OCR, bazal solunum, proton sızıntısı ve maksimum solunumun hesaplanmasını sağlar.
Bazal solunum, bazal OCR ile mitokondriyal olmayan OCR arasındaki farkı temsil eder. Proton sızıntısı, oligomisin enjeksiyonundan sonraki OCR ile mitokondriyal olmayan OCR arasındaki farkı ifade eder. Maksimum solunum, FCCP enjeksiyonundan sonraki OCR ile mitokondriyal olmayan OCR arasındaki farkı temsil eder. Kaplin verimliliği, ATP üretim hızının bazal solunum hızına yüzdesi olarak hesaplanır. Bu yöntem belgesi, Seahorse XFe96 hücre dışı akı analizörünü kullanarak soy negatif HSPC’lerde ECAR ve OCR’yi ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, fare soyu negatif HSPC’leri izole etme yaklaşımlarını açıklar, hücre dışı akı tahlillerinde kullanılan çeşitli ilaçların hücre tohumlama yoğunluğunun ve konsantrasyonlarının optimizasyonunu açıklar ve ilaç tedavi stratejilerini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem makalesi, Seahorse hücre dışı akı analizörü kullanılarak fare HSPC’lerinde hücresel biyoenerjetik (glikoliz ve OxPHOS) değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Bu cihaz, sırasıyla glikoliz ve mitokondriyal solunum ölçümleri olan canlı hücrelerin ECAR ve OCR’sini aynı anda ölçen güçlü bir araçtır. Böylece, hücresel biyoenerjetik değerleri gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, 96 delikli mikroplaka tabanlı platform,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lombard laboratuvarındaki çalışmalar NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 ve ME200030) ve Glenn Tıbbi Araştırma Vakfı tarafından desteklenmektedir. Li laboratuvarındaki çalışmalar NIH (NHLBI 5R01HL150707) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
Referencias
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
- Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
- Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).
- Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
