استخدام كريستال البنفسجي لتحسين البصرية Cytopathic تأثير القائم على القراءة ل Titration الفيروسية باستخدام TCID50 المقايسات
Summary
يظهر هذا البروتوكول نهجا دقيقا وموضوعيا لتصور المعايرة الفيروسية باستخدام اللون البنفسجي البلوري ، من خلال مقارنتها بالفحص المجهري البصري والتلوين الكيميائي المناعي.
Abstract
المعايرة الفيروسية هي المقايسة الرئيسية لأبحاث الفيروسات. الكشف عن تأثير الخلايا (CPE) عن طريق المقايسات TCID50 ووحدات تشكيل البلاك (PFU) المقايسات هي الطريقتين الرئيسيتين لحساب titer من مخزون الفيروس وغالبا ما تستند إلى الكشف المجهري أو تلطيخ الخلايا للتصور. في حالة اختبار TCID50 ، يستند التصور الموضوعي عادة إلى تلطيخ المناعة الكيميائية (ICC) للفيروس داخل الخلايا لحساب الثديات جنبا إلى جنب مع الكشف البصري عن CPE عن طريق المجهر. ومع ذلك ، فإن تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية مكلف ويستغرق وقتا طويلا. في هذه الدراسة، قارنا المراقبة البصرية CPE عن طريق المجهر، تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية وتلطيخ الكريستال البنفسجي لتحديد الثدي من اثنين من الفيروسات تشكيل CPE، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV). نظهر أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ ICC هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية، وتقديم مستويات متطابقة تقريبا من الدقة على كل من IAV وPRRSV. لهذا السبب، نقدم هنا تلطيخ الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50 للفيروسات تشكيل CPE titrated في خطوط الخلية.
Introduction
المعايرة الفيروسية عن طريق TCID50 المقايسة هي تقنية شائعة الاستخدام في أبحاث الأمراض المعدية1. على الرغم من أن الاختلافات في الرياضيات وراء هذه الطريقة قد اقترحت على مدى الوقت1,2,3,4, تعتمد الطرق المطبقة حاليا للكشف عن العدوى على تأكيد بصري من خلال وجود تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) باستخدام المجهر5. لتأكيد التصور CPE أكثر موضوعية على المقايسات TCID50، immunocytochemical (ICC) تلطيخ داخل الخلايا التي تستهدف بروتينات الفيروس هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما6 كما يمكن للفيروسات المختلفة تنتج أشكال مختلفة من CPE. في حالتنا ، فإن التغيرات المورفولوجية للخلايا متشابهة عند إصابتها بكل من فيروس الأنفلونزا A (IAV) وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV) ، حيث تتراكم الخلايا المصابة وتنفصل عن اللوحة. في حالة PRRSV ، فإنه يسبب CPE المعروفة باسم “التدمير الكامل” ، حيث ينتهي الأمر بجميع الخلايا إلى الانفصال عن البئر. IAV من ناحية أخرى، يمكن أن تقدم كل من التدمير الكامل وCPE إضافية تعرف باسم “تدمير المجموع الفرعي” حيث عدد قليل من الخلايا لا تنفصل بعد العدوى7. ومع ذلك، تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا في الأداء وتتطلب استخدام الكواشف المكلفة نسبيا. من المهم ملاحظة أن المحكمة الجنائية الدولية لا تسمي CPE ، بل عدد الخلايا المصابة بنجاح بالفيروس. وهذا يعني أن الخلايا التي أصيبت بنجاح بحلول نهاية الحضانة سينظر إليها على أنها إيجابية حتى لو لم تسبب العدوى CPE حتى الآن ، وبالتالي ، من المتوقع أن تكون نسبة أعلى من الخلايا الإيجابية للمحكمة الجنائية الدولية مقارنة ب CPE. لهذا السبب، في هذه الدراسة نصف طريقة تكميلية للكشف البصري عن CPE في اختبار TCID50 على أساس البنفسجي الكريستال، وهي مادة كيميائية مع تهمة إيجابية التي تعلق على أغشية الخلايا ويستخدم لتلطخ الخلايا الملتصقة. وغالبا ما يستخدم الكريستال البنفسجي في بحوث علم الفيروسات لقياس وحدات تشكيل البلاك، من بين أمور أخرى8.
في هذه الدراسة، نقارن حساسية الكشف عن ال CPE المجهر غير الملون مع تلطيخ الكريستال البنفسجي وتلطيخ المناعة الكيميائية على أساس التعرف على البروتين الفيروسي، والذي هو معروف أن يكون أكثر موضوعية نظرا لحساسية عالية. وتبين هذه الدراسة أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ الكيميائية المناعية هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية القائمة على المجهر ويمكن استخدامها لتحديد موضوعي الآبار المصابة في المعايرة TCID50. نظرا لقدرتها على الوصول إلى مستوى مماثل تقريبا من الدقة على الفيروسات الباثاثية اختبارها في خطوط الخلية، يتم تقديم الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50. الطريقة المقترحة باستخدام الكريستال البنفسجي تلطيخ يستغرق ما مجموعه 40 دقيقة لأداء، مع 15 دقيقة لاحتضان paraformaldehyde (PFA)، 5 دقائق لاحتضان الكريستال البنفسجي والحد الأقصى من 15 دقيقة لإعداد المواد، يغسل العازلة، والتجفيف. بروتوكول الكيمياء المناعية المطبق للمقارنة يستغرق متوسط الوقت 4 ساعة 30 دقيقة، وكان يؤديها كما هو موضح سابقا9،10. وتهدف الطريقة المقترحة إلى المساعدة في تصور المعايرة الفيروسية المكتملة. يمكن إجراء العدوى وأوقات الحضانة مع تخطيط مختلف اعتمادا على الفيروس. هنا اختبرنا اثنين من فيروسات الحمض النووي الريبي مع تأثير cytopathic على خطوط الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستخدم المعايرة الفيروسية بشكل روتيني في أبحاث الفيروسات، مع الكشف عن PFU وتقيايس TCID50 الأكثر استخداما1،2،3،4. تعتمد كلتا الطريقتين على اكتشاف CPE في الخلايا المصابة ، وعلى الرغم من أنه يمكن تقييمها بصريا عن طريق المج…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور فرانك شولي لتعليقاته المفيدة في المخطوطة، وكلوي ماريانت لمساعدتها في تصوير المجهر وتيريزا م. تيدج لتنقيحها المفيد للغة الإنجليزية.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Referencias
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg’s Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss’s formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C. Cytopathic effects of viruses protocols. American Society of Microbiology. , (2007).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. . Influenza Virus. , 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
