שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays
Summary
פרוטוקול זה מציג גישה מדויקת ואובייקטיבית לדמיין טיטריוציות ויראליות באמצעות סגול קריסטל, על ידי השוואתו עם מיקרוסקופיה אופטית וכתמים אימונוציטוכימיים.
Abstract
טיטציה ויראלית היא בדיקת מפתח למחקר וירולוגיה. זיהוי של אפקט ציטוטופתי (CPE) באמצעות בדיקות TCID50 ויחידות יוצרות פלאק (PFU) הן שתי השיטות העיקריות לחישוב טיטר של מלאי וירוסים ומבוססות לעתים קרובות על זיהוי מיקרוסקופיה או כתמי תאים להדמיה. במקרה של TCID50 assay, ויזואליזציה אובייקטיבית מבוססת בדרך כלל על כתמים אימונוציטוכימיים (ICC) של וירוס תאי לחישוב titers בשילוב עם זיהוי CPE חזותי באמצעות מיקרוסקופיה. עם זאת, כתמי בית הדין הפלילי הבינלאומי יקרים וגוזלים זמן רב. במחקר זה, השווינו תצפית CPE חזותית באמצעות מיקרוסקופיה, כתמי ICC וכתמים סגול קריסטל כדי לקבוע את titers של שני וירוסים יוצרי CPE, וירוס שפעת A (IAV) ממוצא חזירים ווירוס הרבייה והנשימה חזירית (PRRSV). אנו מראים כי הן הכתמת קריסטל סגול ו- ICC מדויקות יותר מזיהוי CPE חזותי, ומציגות רמות דיוק כמעט זהות הן ב- IAV והן ב- PRRSV. מסיבה זו, כאן אנו מציגים כתמים סגול קריסטל כדרך מהירה ובמחיר סביר יותר לקבוע titrations ויראלי על TCID50 assay עבור וירוסים יוצרי CPE titrated בשורות התא.
Introduction
טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 assay היא טכניקה נפוצה במחקר מחלות זיהומיות1. למרות וריאציות על המתמטיקה מאחורי שיטה זו הוצעו לאורך זמן1,2,3,4, השיטות המיושמות כיום של זיהוי זיהום מסתמכות על אישור חזותי באמצעות נוכחות של אפקט ציטוטופתי (CPE) באמצעות microscopy5. כדי לאשר הדמיה CPE אובייקטיבית יותר על TCID50 assays, immunocytochemical (ICC) כתמים תאיים מיקוד החלבונים של הנגיף היא אחת השיטות הנפוצות ביותר6 כמו וירוסים שונים יכולים לייצר צורות שונות של CPE. במקרה שלנו, השינויים המורפולוגיים של התא דומים כאשר נגועים הן בנגיף שפעת A (IAV) והן בווירוס הרבייה והתסמונת הנשימתית החזירית (PRRSV), שם תאים נגועים אוספים ומתנתקים מהצלחת. במקרה של PRRSV, זה גורם CPE המכונה “הרס מוחלט”, שבו כל התאים בסופו של דבר ניתוק מן הבאר. IAV לעומת זאת, יכול להציג הן הרס מוחלט והן CPE נוסף המכונה “הרס סכום ביניים” שבו מספר קטן של תאים אינם מתנתקים לאחר זיהום7. עם זאת, טכניקה זו גוזלת זמן רב לביצוע ודורש שימוש ריאגנטים יקרים יחסית. חשוב לציין כי ICC אינו מתייג CPE, אלא את מספר התאים שנדבקו בהצלחה על ידי הנגיף. משמעות הדבר היא כי התאים שנדבקו בהצלחה עד סוף הדגירה ייראו כחיוביים גם אם הזיהום עדיין לא גרם ל- CPE, ולכן, צפוי אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים של ICC בהשוואה ל- CPE. מסיבה זו, במחקר זה אנו מתארים שיטה משלימה של זיהוי חזותי של CPE ב TCID50 assay המבוסס על סגול קריסטל, כימי עם מטען חיובי המתחבר קרום התא ומשמש להכתים תאים דבקים. סגול קריסטל משמש לעתים קרובות במחקר וירולוגיה כדי למדוד יחידות יוצרות פלאק, בין היתר8.
במחקר זה, אנו משווים את הרגישות של זיהוי CPE מיקרוסקופי לא מוכתם עם כתמים סגול קריסטל וכתמים אימונוציטוכימיים המבוססים על זיהוי חלבון ויראלי, אשר ידוע להיות אובייקטיבי יותר בשל הרגישות הגבוהה שלה. מחקר זה מראה כי הן סגול קריסטל וחיסון כתמים מדויקים יותר מאשר זיהוי CPE מבוסס מיקרוסקופיה חזותית וניתן להשתמש בהם כדי לזהות באופן אובייקטיבי בארות נגועות TCID50 titration. בהתחשב ביכולתם להגיע לרמת דיוק כמעט זהה על וירוסים ציטוטופתיים שנבדקו בקווי תאים, סגול קריסטל מוצג כדרך מהירה ובמחיר סביר יותר לקבוע טיטריוציות ויראליות על TCID50 assay. השיטה המוצעת באמצעות כתמים סגול קריסטל לוקח זמן כולל של 40 דקות לבצע, עם 15 דקות עבור דגירה paraformaldehyde (PFA), 5 דקות עבור דגירה סגול קריסטל מקסימום של 15 דקות להכנת חומר, שחיץ, וייבוש. פרוטוקול אימונוציטוכימיה שהוחל להשוואה לוקח זמן ממוצע של 4 שעות 30 דקות ובוצע כפי שתואר בעבר9,10. השיטה המוצעת נועדה לעזור לדמיין טיטציה ויראלית שהושלמה. זמני זיהום ודגרה יכולים להתבצע בפריסה שונה בהתאם לנגיף. כאן בדקנו שני וירוסי RNA עם השפעה ציטוטפתית על קווי התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
טייטציות ויראליות משמשות באופן שגרתי במחקר וירולוגיה, עם זיהוי PFU וביקורי TCID50 הנפוצים ביותר 1,2,3,4. שתי השיטות מסתמכות על זיהוי CPE בתאים נגועים, ולמרות שניתן להעריך אותם חזותית באמצעות מיקרוסקופיה, כתמים מוחלים בדרך …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר פרנק שולר על הערותיו המועילות בכתב היד, קלואי מריאנט על עזרתה בתמונות המיקרוסקופיה ותרזה מ. טדג’ על הגרסה האנגלית המועילה שלה.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Referencias
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg’s Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss’s formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C. Cytopathic effects of viruses protocols. American Society of Microbiology. , (2007).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. . Influenza Virus. , 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
