Uso de crystal violet para mejorar la lectura basada en el efecto citopático visual para la valoración viral utilizando ensayos TCID50
Summary
Este protocolo muestra un enfoque preciso y objetivo para visualizar las valoraciones virales utilizando cristal violeta, comparándolo con la microscopía óptica y la tinción inmunocitoquímica.
Abstract
La titulación viral es un ensayo clave para la investigación en virología. La detección del efecto citopático (CPE) a través de ensayos TCID50 y ensayos de unidades formadoras de placa (PFU) son los dos métodos principales para calcular el título de un stock de virus y a menudo se basan en la detección de microscopía o tinción celular para la visualización. En el caso del ensayo TCID50, la visualización objetiva se basa comúnmente en la tinción inmunocitoquímica (ICC) del virus intracelular para calcular los títulos combinados con la detección visual de CPE a través de microscopía. Sin embargo, la tinción ICC es costosa y requiere mucho tiempo. En este estudio, comparamos la observación visual de CPE a través de microscopía, tinción ICC y tinción violeta cristalina para determinar los títulos de dos virus formadores de CPE, el virus de la influenza A (IAV) de origen porcino y el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Demostramos que tanto la tinción violeta cristalina como la ICC son más precisas que la detección visual de CPE, presentando niveles casi idénticos de precisión tanto en IAV como en PRRSV. Por esta razón, aquí presentamos la tinción violeta cristalina como una forma más rápida y asequible de determinar las valoraciones virales en un ensayo TCID50 para virus formadores de CPE titulados en líneas celulares.
Introduction
La titulación viral mediante ensayo TCID50 es una técnica de uso común en la investigación de enfermedades infecciosas1. Aunque a lo largo del tiempo se han propuesto variaciones en las matemáticas detrás de este método1,2,3,4, los métodos de detección de infecciones actualmente aplicados se basan en la confirmación visual a través de la presencia de efecto citopático (CPE) mediante microscopía5. Para confirmar la visualización de CPE de manera más objetiva en los ensayos TCID50, la tinción intracelular inmunocitoquímica (ICC) dirigida a las proteínas del virus es uno de los métodos más utilizados6, ya que diferentes virus pueden producir diferentes formas de CPE. En nuestro caso, los cambios morfológicos celulares son similares cuando se infectan tanto con el virus de la influenza A (IAV) como con el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), donde las células infectadas se redondean y se desprenden de la placa. En el caso del PRRSV, provoca un CPE conocido como “destrucción total”, donde todas las células acaban desprendiéndose del pozo. La IAV, por otro lado, puede presentar tanto destrucción total como un CPE adicional conocido como “destrucción subtotal” donde un pequeño número de células no se desprenden después de la infección7. Sin embargo, esta técnica requiere mucho tiempo para realizarse y requiere el uso de reactivos relativamente costosos. Es importante tener en cuenta que ICC no etiqueta CPE, sino más bien el número de células infectadas con éxito por el virus. Esto implica que las células que se infectaron con éxito al final de la incubación se verán como positivas incluso si la infección aún no ha causado CPE y, por lo tanto, se espera un mayor porcentaje de células ICC positivas en comparación con CPE. Por esa razón, en este estudio describimos un método complementario de detección visual de CPE en un ensayo TCID50 basado en cristal violeta, un químico con una carga positiva que se adhiere a las membranas celulares y se utiliza para teñir las células adherentes. El violeta cristalino se utiliza a menudo en la investigación virológica para medir las unidades formadoras de placa, entre otros8.
En este estudio, comparamos la sensibilidad de la detección de CPE por microscopía no teñida con la tinción violeta cristalina y la tinción inmunocitoquímica basada en el reconocimiento de proteínas virales, que se sabe que es más objetiva debido a su alta sensibilidad. Este estudio muestra que tanto la tinción violeta cristalina como la inmunocitoquímica son más precisas que la detección de CPE basada en microscopía visual y se pueden usar para identificar objetivamente los pozos infectados en una titulación TCID50. Dada su capacidad para alcanzar un nivel casi idéntico de precisión en los virus citopáticos probados en líneas celulares, el violeta cristalino se presenta como una forma más rápida y asequible de determinar las valoraciones virales en un ensayo TCID50. El método propuesto que utiliza la tinción violeta cristalina tarda un tiempo total de 40 minutos en realizarse, con 15 minutos para la incubación de paraformaldehído (PFA), 5 minutos para la incubación de violeta cristalina y un máximo de 15 minutos para la preparación del material, los lavados tampón y el secado. El protocolo de inmunocitoquímica aplicado para la comparación tiene un tiempo medio de 4 h 30 min y se realizó como se describió anteriormente9,10. El método propuesto tiene como objetivo ayudar a visualizar una titulación viral completa. Los tiempos de infección e incubación se pueden realizar con diferentes diseños dependiendo del virus. Aquí probamos dos virus de ARN con efecto citopático en líneas celulares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las valoraciones virales se utilizan habitualmente en la investigación virológica, siendo la detección de PFU y los ensayos TCID50 los más utilizados1,2,3,4. Ambos métodos se basan en la detección de CPE en células infectadas, y aunque se pueden evaluar visualmente mediante microscopía, se suele aplicar una tinción para obtener un resultado más objetivo o incluso para reducir…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Frank Scholle por sus útiles comentarios en el manuscrito, a Chloe Mariant por su ayuda con las imágenes de microscopía y a Teresa M. Tiedge por su útil revisión en inglés.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
Referencias
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