El presente protocolo describe la precipitación de proteínas a base de disolventes en condiciones controladas para una recuperación y purificación robustas y rápidas de muestras de proteoma antes de la espectrometría de masas.
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Artículo de método
Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas
En este artículo
Resumen
Resumen
Si bien los múltiples avances en los instrumentos de espectrometría de masas (EM) han mejorado el análisis cualitativo y cuantitativo del proteoma, los enfoques frontales más confiables para aislar, enriquecer y procesar proteínas antes de la EM son críticos para una caracterización exitosa del proteoma. La recuperación de proteínas baja e inconsistente y las impurezas residuales como los surfactantes son perjudiciales para el análisis de la EM. La precipitación de proteínas a menudo se considera poco confiable, requiere mucho tiempo y técnicamente es difícil de realizar en comparación con otras estrategias de preparación de muestras. Estas preocupaciones se superan mediante el empleo de protocolos óptimos de precipitación de proteínas. Para la precipitación de acetona, la combinación de sales específicas, el control de la temperatura, la composición del disolvente y el tiempo de precipitación es crítica, mientras que la eficiencia de la precipitación de cloroformo / metanol / agua depende del pipeteo adecuado y la manipulación del vial. Alternativamente, estos protocolos de precipitación están optimizados y semiautomatizados dentro de un cartucho de centrifugado desechable. Los resultados esperados de la precipitación de proteínas a base de solvente en el formato convencional y el uso de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas se ilustran en este trabajo. Esto incluye la caracterización detallada de mezclas proteómicas mediante análisis LC-MS/MS de abajo hacia arriba. El rendimiento superior de los flujos de trabajo basados en SDS también se demuestra en relación con las proteínas no contaminadas.
Introducción
El análisis del proteoma por espectrometría de masas se ha vuelto cada vez más riguroso, debido a la mayor sensibilidad, resolución, velocidad de escaneo y versatilidad de los instrumentos modernos de MS. Los avances de la EM contribuyen a una mayor eficiencia de identificación de proteínas y a una cuantificación más precisa 1,2,3,4,5. Con una instrumentación mejorada de em, los investigadores exigen una estrategia de preparación de muestras front-end correspondientemente consistente capaz de recuperar cuan....
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Protocolo
1. Consideraciones materiales y preparación previa de la muestra
- Use solo solventes de alta pureza (acetona, cloroformo, metanol) (>99.5%) y productos químicos, libres de exceso de humedad.
- Preparar soluciones de cloruro de sodio y sulfato de zinc (1 M) en agua.
NOTA: Las soluciones salinas se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, siempre y cuando estén libres de contaminantes o crecimiento microbiano. - Utilice el vial de microcentrífuga de polipropileno (PP) más pequeño suficiente para retener el volumen requerido de muestra y disolventes para inducir la precipitación.
- Asegúrese de que la c....
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Resultados
La Figura 4 resume el agotamiento esperado de SDS después de la precipitación de proteínas a base de vial o facilitada por cartucho en un cartucho de filtro desechable utilizando acetona. La incubación nocturna convencional (-20 °C) en acetona se compara con el protocolo de precipitación rápida de acetona a temperatura ambiente (paso 2), así como con la precipitación CMW (paso 4). La SDS residual se cuantificó mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS)
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Discusión
La caracterización óptima de la EM se logra cuando la SDS residual se agota por debajo de 10 ppm. Mientras que los enfoques alternativos, como el FASP y la digestión en perlas, ofrecen un agotamiento cuantitativo de SDS con recuperación variable 31,32,33, el objetivo principal de la precipitación es maximizar la pureza y el rendimiento simultáneamente. Esto depende de aislar efectivamente el sobrenadante (que contiene el SDS) si.......
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Divulgaciones
El laboratorio Doucette concibió y patentó el ProTrap XG empleado en este estudio. AAD también es socio fundador de Proteoform Scientific, que comercializó el cartucho de preparación de muestras.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá. Los autores agradecen a Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canadá) y SPARC BioCentre (Análisis Molecular) en el Hospital para Niños Enfermos (Toronto, Canadá) por sus contribuciones a la adquisición de datos de EM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetona | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤ 0,002 % aldehído |
| Acetonitrilo | Fisher Scientific | A998-4 | Grado HPLC |
| Bicarbonato de amonio | Millipore Sigma | A6141-1KG | sólido |
| Beta mercaptoetanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Grado en biología molecular |
| Azul de bromofenol | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromofenol sal azula de sodio |
| Cloroformo | Fisher Scientific | C298-400 | Cloroformo |
| Ácido fórmico | Honeywell | 56302 | Aditivo eluent para LC-MS |
| Espectrómetro de Masas Lumos de Fusión | ThermoFisher Scientific | para el análisis de mezclas estándar de proteínas | |
| Glicerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | En biología molecular, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | Grado HPLC |
| Metanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | Grado HPLC |
| Microcentrífuga | Fisher Scientific | 75-400-102 | Hasta 21.000 XG |
| Tubo microcentrífuga (1,5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | Fondo cónico |
| Tubo de microcentrífugas y nbsp; (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | Fondo redondeado |
| Puntas de micropipetas (0.1-10 μ L) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Punta universal de pipéta, no estéril |
| Puntas de micropipetas (1-200 μ L) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Punta universal de pipéta, no estéril |
| Puntas de micropipetas (200-1000 y mu; L) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Punta universal de pipéta, no estéril |
| Micropipetas | Fisher Scientific | 13-710-903 | Pack de tríos de micropipetas |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Polvo liofilizado, >3200 unidades/mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 unidades completas por caja |
| Cloruro de sodio | Millipore Sigma | S9888-1KG | Reactivo ACS, >99 % |
| Dodecilo sulfato de sodio | ThermoFisher Scientific | 28312 | Sólido en polvo |
| Espectrómetro de Masas TimsTOF Pro | Bruker | para el análisis del extracto de proteoma hepático | |
| Ácido trifluoroacético | ThermoFisher Scientific | L06374. AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Grado en biología molecular |
| Tripsina | Millipore Sigma | 9002-07-7 | Procedente del páncreas bovino, tratado con TPCK |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | sólido |
| Agua (desionizada) | Sistema de Purificación de Agua Mini Sartorius Arium | 76307-662 | Ultrapura tipo 1 (18,2 MΩ cm) |
| Sulfato de zinc | Millipore Sigma | 307491-100G | sólido |
Referencias
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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Reimpresiones y permisos
