Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas

Summary

El presente protocolo describe la precipitación de proteínas a base de disolventes en condiciones controladas para una recuperación y purificación robustas y rápidas de muestras de proteoma antes de la espectrometría de masas.

Abstract

Si bien los múltiples avances en los instrumentos de espectrometría de masas (EM) han mejorado el análisis cualitativo y cuantitativo del proteoma, los enfoques frontales más confiables para aislar, enriquecer y procesar proteínas antes de la EM son críticos para una caracterización exitosa del proteoma. La recuperación de proteínas baja e inconsistente y las impurezas residuales como los surfactantes son perjudiciales para el análisis de la EM. La precipitación de proteínas a menudo se considera poco confiable, requiere mucho tiempo y técnicamente es difícil de realizar en comparación con otras estrategias de preparación de muestras. Estas preocupaciones se superan mediante el empleo de protocolos óptimos de precipitación de proteínas. Para la precipitación de acetona, la combinación de sales específicas, el control de la temperatura, la composición del disolvente y el tiempo de precipitación es crítica, mientras que la eficiencia de la precipitación de cloroformo / metanol / agua depende del pipeteo adecuado y la manipulación del vial. Alternativamente, estos protocolos de precipitación están optimizados y semiautomatizados dentro de un cartucho de centrifugado desechable. Los resultados esperados de la precipitación de proteínas a base de solvente en el formato convencional y el uso de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas se ilustran en este trabajo. Esto incluye la caracterización detallada de mezclas proteómicas mediante análisis LC-MS/MS de abajo hacia arriba. El rendimiento superior de los flujos de trabajo basados en SDS también se demuestra en relación con las proteínas no contaminadas.

Introduction

El análisis del proteoma por espectrometría de masas se ha vuelto cada vez más riguroso, debido a la mayor sensibilidad, resolución, velocidad de escaneo y versatilidad de los instrumentos modernos de MS. Los avances de la EM contribuyen a una mayor eficiencia de identificación de proteínas y a una cuantificación más precisa 1,2,3,4,5. Con una instrumentación mejorada de em, los investigadores exigen una estrategia de preparación de muestras front-end correspondientemente consistente capaz de recuperar cuantitativamente proteínas de alta pureza en un tiempo mínimo en todas las etapas del flujo de trabajo 6,7,8,9,10,11 . Para reflejar con precisión el estado del proteoma de un sistema biológico, las proteínas deben aislarse de la matriz de muestra nativa de manera eficiente e imparcial. Con este fin, la inclusión de un surfactante desnaturalizante, como el dodecil sulfato de sodio (SDS), garantiza una extracción y solubilización eficientes de proteínas¹². Sin embargo, SDS interfiere fuertemente con la ionización por electropulverización, causando una severa supresión de la señal de EM si no se elimina adecuadamente¹³.

Existen varias estrategias de agotamiento de SDS para el posterior análisis del proteoma, como la retención de proteínas por encima de un filtro de corte de peso molecular contenido en cartuchos de espín desechables 14,15,16. El método de preparación de muestras asistido por filtro (FASP) se ve favorecido ya que agota efectivamente el SDS por debajo de 10 ppm, lo que facilita una EM óptima. Sin embargo, la recuperación de proteínas con FASP es variable, lo que impulsó la exploración de otras técnicas. Los enfoques cromatográficos que capturan selectivamente proteínas (o surfactantes) han evolucionado en varios cartuchos convenientes o formatos basados en cuentas 17,18,19,20,21. Dadas estas estrategias simples y (idealmente) consistentes para la purificación de proteínas, el enfoque clásico de la precipitación de proteínas con solventes orgánicos a menudo se pasa por alto como un enfoque prometedor para el aislamiento de proteínas. Si bien se ha demostrado que la precipitación con disolvente agota la SDS por debajo de los niveles críticos con éxito, la recuperación de proteínas ha sido una preocupación de larga data de este enfoque. Múltiples grupos han observado un sesgo de recuperación de proteínas, con rendimientos de precipitación inaceptablemente bajos en función de la concentración de proteínas, el peso molecular y la hidrofobicidad^22,23. Debido a la diversidad de protocolos de precipitación reportados en la literatura, se desarrollaron condiciones de precipitación estandarizadas. En 2013, Crowell et al. informaron por primera vez la dependencia de la fuerza iónica en la eficiencia de precipitación de las proteínas en el 80% de acetona²⁴. Para todas las proteínas examinadas, se demostró que la adición de cloruro de sodio de hasta 30 mM era esencial para maximizar los rendimientos (hasta un 100% de recuperación). Más recientemente, Nickerson et al. demostraron que la combinación de una fuerza iónica aún mayor (hasta 100 mM) con una temperatura elevada (20 ° C) durante la precipitación de acetona dio una recuperación casi cuantitativa en 2-5 min²⁵. Se observó una ligera caída en la recuperación de proteínas de bajo peso molecular (LMW). Por lo tanto, un informe posterior de Baghalabadi et al. demostró la recuperación exitosa de proteínas y péptidos LMW (≤5 kDa) mediante la combinación de sales específicas, particularmente sulfato de zinc, con un mayor nivel de disolvente orgánico (97% acetona)²⁶.

Si bien refinar el protocolo de precipitación brinda una estrategia de purificación de proteínas más confiable para la proteómica basada en la EM, el éxito de la precipitación convencional depende en gran medida de la técnica del usuario. Un objetivo principal de este trabajo es presentar una estrategia de precipitación robusta que facilite el aislamiento del pellet de proteína del sobrenadante contaminante. Se desarrolló un cartucho de filtración desechable para eliminar el pipeteo aislando la proteína agregada sobre un filtro de membrana de PTFE poroso²⁷. Los componentes que interfieren con la EM en el sobrenadante se eliminan eficazmente en un paso de centrifugación corto y de baja velocidad. El cartucho de filtro desechable también ofrece un cartucho SPE intercambiable, que facilita la limpieza posterior de la muestra después de la resolubilización y la digestión opcional de proteínas, antes de la espectrometría de masas.

Aquí se presentan una serie de flujos de trabajo de precipitación de proteoma recomendados, incluidos los protocolos modificados de acetona y cloroformo / metanol / agua²⁸ , en un formato convencional (basado en viales) y semiautomatizado en un cartucho desechable de filtración y extracción de dos estados. Se destacan las recuperaciones de proteínas resultantes y las eficiencias de agotamiento de SDS, junto con la cobertura de proteoma LC-MS/MS de abajo hacia arriba, para demostrar el resultado esperado de cada protocolo. Se discuten los beneficios prácticos y los inconvenientes asociados con cada enfoque.

Protocol

1. Consideraciones materiales y preparación previa de la muestra Use solo solventes de alta pureza (acetona, cloroformo, metanol) (>99.5%) y productos químicos, libres de exceso de humedad. Preparar soluciones de cloruro de sodio y sulfato de zinc (1 M) en agua.NOTA: Las soluciones salinas se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, siempre y cuando estén libres de contaminantes o crecimiento microbiano. Utilice el vial de microcentrífuga de polipropi…

Representative Results

La Figura 4 resume el agotamiento esperado de SDS después de la precipitación de proteínas a base de vial o facilitada por cartucho en un cartucho de filtro desechable utilizando acetona. La incubación nocturna convencional (-20 °C) en acetona se compara con el protocolo de precipitación rápida de acetona a temperatura ambiente (paso 2), así como con la precipitación CMW (paso 4). La SDS residual se cuantificó mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS)<sup …

Discussion

La caracterización óptima de la EM se logra cuando la SDS residual se agota por debajo de 10 ppm. Mientras que los enfoques alternativos, como el FASP y la digestión en perlas, ofrecen un agotamiento cuantitativo de SDS con recuperación variable 31,32,33, el objetivo principal de la precipitación es maximizar la pureza y el rendimiento simultáneamente. Esto depende de aislar efectivamente el sobrenadante (que contiene el S…

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid