Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

Summary

O presente protocolo descreve a precipitação de proteínas à base de solventes em condições controladas para recuperação e purificação robustas e rápidas de amostras de proteome antes da espectrometria de massa.

Abstract

Embora os múltiplos avanços nos instrumentos de espectrometria de massa (MS) tenham melhorado a análise qualitativa e quantitativa do proteome, abordagens front-end mais confiáveis para isolar, enriquecer e processar proteínas à frente da ES são fundamentais para uma caracterização proteome bem-sucedida. Recuperação de proteínas baixas e inconsistentes e impurezas residuais, como surfactantes, são prejudiciais à análise de ESM. A precipitação proteica é muitas vezes considerada não confiável, demorada e tecnicamente desafiadora de executar em comparação com outras estratégias de preparação da amostra. Essas preocupações são superadas pela utilização de protocolos ideais de precipitação de proteínas. Para precipitação de acetona, a combinação de sais específicos, controle de temperatura, composição de solventes e tempo de precipitação é crítica, enquanto a eficiência da precipitação de clorofórmio/metanol/água depende da manipulação adequada da tubulação e do frasco. Alternativamente, esses protocolos de precipitação são simplificados e semi-automatizados dentro de um cartucho de spin descartável. Os resultados esperados da precipitação proteica à base de solventes no formato convencional e utilizando um cartucho descartável de filtragem e extração em dois estágios são ilustrados neste trabalho. Isso inclui a caracterização detalhada das misturas proteômicas por análise de LC-MS/MS de baixo para cima. O desempenho superior dos fluxos de trabalho baseados em SDS também é demonstrado em relação à proteína não contaminada.

Introduction

A análise proteome por espectrometria de massa tornou-se cada vez mais rigorosa, devido à sensibilidade, resolução, velocidade de varredura aprimorada e versatilidade dos instrumentos modernos de ESM. Os avanços em MS contribuem para maior eficiência de identificação de proteínas e uma quantitação mais precisa 1,2,3,4,5. Com a melhor instrumentação de ES, os pesquisadores exigem uma estratégia de preparação de amostra frontal correspondentemente consistente capaz de recuperação quantitativa de proteínas de alta pureza em tempo mínimo em todas as etapas do fluxo de trabalho 6,7,8,9,10,11 . Para refletir com precisão o estado proteome de um sistema biológico, as proteínas devem ser isoladas da matriz amostral nativa de forma eficiente e imparcial. Para isso, incluir um surfactante de desnaturação, como sulfato de dodecil de sódio (SDS), garante a extração eficiente de proteínas e solubilização¹². No entanto, a SDS interfere fortemente na ionização de eletrospray, causando supressão severa de sinal de MS se não for devidamente eliminada¹³.

Várias estratégias de esgotamento do SDS estão disponíveis para análises proteome subsequentes, como a retenção de proteínas acima de um filtro de corte de peso molecular contido dentro de cartuchos de spin descartáveis 14,15,16. O método de preparação da amostra auxiliado por filtro (FASP) é favorecido, pois efetivamente esgota o SDS abaixo de 10 ppm, facilitando a MS ideal. No entanto, a recuperação de proteínas com FASP é variável, o que motivou a exploração de outras técnicas. Abordagens cromatográficas que capturam seletivamente proteína (ou surfactante) evoluíram em vários cartuchos convenientes ou formatos baseados em contas 17,18,19,20,21. Dadas essas estratégias simples e (idealmente) consistentes para a purificação de proteínas, a abordagem clássica da precipitação de proteínas com solventes orgânicos é muitas vezes negligenciada como uma abordagem promissora para o isolamento proteico. Embora a precipitação de solventes seja demonstrada para esgotar a SDS abaixo dos níveis críticos com sucesso, a recuperação de proteínas tem sido uma preocupação de longa data dessa abordagem. Vários grupos observaram um viés de recuperação de proteínas, com rendimentos inaceitáveis de baixa precipitação em função da concentração de proteínas, peso molecular e hidrofobitude^22,23. Devido à diversidade de protocolos de precipitação relatados na literatura, foram desenvolvidas condições padronizadas de precipitação. Em 2013, Crowell et al. relataram pela primeira vez a dependência da força iônica na eficiência de precipitação das proteínas em 80% de acetona²⁴. Para todas as proteínas examinadas, a adição de até 30 mM de cloreto de sódio mostrou-se essencial para maximizar os rendimentos (até 100% de recuperação). Mais recentemente, Nickerson et al. mostraram que a combinação de força iônica ainda maior (até 100 mM) com temperatura elevada (20 °C) durante a precipitação de acetona deu recuperação quase quantitativa em 2-5 min²⁵. Observou-se uma ligeira queda na recuperação de proteínas de baixo peso molecular (LMW). Portanto, um relatório subsequente de Baghalabadi et al. demonstrou a recuperação bem sucedida de proteínas LMW e peptídeos (≤5 kDa) combinando sais específicos, particularmente sulfato de zinco, com um nível mais alto de solvente orgânico (97% acetona)²⁶.

Embora o refino do protocolo de precipitação dê uma estratégia de purificação de proteínas mais confiável para a proteômica baseada em MS, o sucesso da precipitação convencional depende fortemente da técnica do usuário. O objetivo principal deste trabalho é apresentar uma estratégia robusta de precipitação que facilite o isolamento da pelota de proteína do supernanato contaminante. Um cartucho de filtragem descartável foi desenvolvido para eliminar a pipetação isolando a proteína agregada acima de um filtro de membrana PTFE porosa²⁷. Os componentes que interferem em MS no supernante são efetivamente removidos em uma etapa de centrifugação de baixa velocidade. O cartucho de filtro descartável também oferece um cartucho SPE intercambiável, o que facilita a limpeza subsequente da amostra após a resolubilização e digestão de proteínas opcionais, à frente da espectrometria de massa.

Uma série de fluxos de trabalho recomendados de precipitação proteome são apresentados aqui, incluindo protocolos modificados de acetona e clorofórmio/metanol/água²⁸ , em um formato convencional (à base de frasco) e um formato semi-automatizado em um cartucho descartável de filtragem e extração de dois estados. Destacam-se as recuperações de proteínas resultantes e a eficiência de esgotamento do SDS, juntamente com a cobertura proteome LC-MS/MS de baixo para cima, para demonstrar o resultado esperado de cada protocolo. São discutidos os benefícios práticos e as desvantagens associados a cada abordagem.

Protocol

1. Considerações materiais e pré-preparação da amostra Utilize apenas solventes de alta pureza (acetona, clorofórmio, metanol) (>99,5%) e produtos químicos, livres de excesso de umidade. Prepare as soluções de cloreto de sódio e sulfato de zinco (1 M) na água.NOTA: As soluções de sal podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, desde que estejam livres de contaminantes ou crescimento microbiano. Use o menor frasco de microcentrífugo de pol…

Representative Results

A Figura 4 resume o esgotamento esperado do SDS após a precipitação facilitada por frascos ou cartuchos de proteínas em um cartucho de filtro descartável usando acetona. A incubação noturna convencional (-20 °C) em acetona é comparada com o protocolo de precipitação de acetona rápida à temperatura ambiente (passo 2), bem como a precipitação cmw (passo 4). A SDS residual foi quantificada pelo ensaio 29 das substâncias ativas azul-metileno (MBAS). Resumi…

Discussion

A caracterização ótima de MS é alcançada quando o SDS residual é esgotado abaixo de 10 ppm. Enquanto abordagens alternativas, como FASP e digestão on-bead, oferecem esgotamento quantitativo de SDS com recuperação variável ^31,32,33, o objetivo principal da precipitação é maximizar a pureza e o rendimento simultaneamente. Isso depende de isolar efetivamente o supernasce (contendo o SDS) sem perturbar a pelota de prote…

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid