Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.
Hoewel meerdere ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) -instrumenten de kwalitatieve en kwantitatieve proteoomanalyse hebben verbeterd, zijn betrouwbaardere front-endbenaderingen om eiwitten te isoleren, verrijken en verwerken vóór MS van cruciaal belang voor succesvolle proteoomkarakterisering. Lage, inconsistente eiwitterugwinning en resterende onzuiverheden zoals oppervlakteactieve stoffen zijn schadelijk voor MS-analyse. Eiwitprecipitatie wordt vaak als onbetrouwbaar, tijdrovend en technisch uitdagend beschouwd om uit te voeren in vergelijking met andere monstervoorbereidingsstrategieën. Deze zorgen worden overwonnen door gebruik te maken van optimale eiwitprecipitatieprotocollen. Voor acetonprecipitatie is de combinatie van specifieke zouten, temperatuurregeling, oplosmiddelsamenstelling en precipitatietijd van cruciaal belang, terwijl de efficiëntie van chloroform / methanol / waterprecipitatie afhankelijk is van de juiste pipettering en flaconmanipulatie. Als alternatief zijn deze neerslagprotocollen gestroomlijnd en semi-geautomatiseerd in een wegwerpspincartridge. De verwachte resultaten van eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen in het conventionele formaat en met behulp van een wegwerp-, tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon worden in dit werk geïllustreerd. Dit omvat de gedetailleerde karakterisering van proteomische mengsels door bottom-up LC-MS/MS-analyse. De superieure prestaties van sds-gebaseerde workflows worden ook aangetoond ten opzichte van niet-verontreinigde eiwitten.
Proteoomanalyse door massaspectrometrie is steeds rigoureuzer geworden, vanwege de verbeterde gevoeligheid, resolutie, scansnelheid en veelzijdigheid van moderne MS-instrumenten. Ms-vooruitgang draagt bij aan een grotere efficiëntie van eiwitidentificatie en nauwkeuriger kwantificering 1,2,3,4,5. Met verbeterde MS-instrumentatie eisen onderzoekers een overeenkomstig consistente front-end monstervoorbereidingsstrategie die in staat is tot kwantitatief herstel van zeer zuivere eiwitten in minimale tijd in alle stadia van de workflow 6,7,8,9,10,11 . Om de proteoomstatus van een biologisch systeem nauwkeurig weer te geven, moeten eiwitten op een efficiënte en onbevooroordeelde manier uit de inheemse monstermatrix worden geïsoleerd. Hiertoe zorgt het opnemen van een denaturerende oppervlakteactieve stof, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), voor efficiënte eiwitextractie en oplosbaarheid12. SDS interfereert echter sterk met elektrospray-ionisatie, waardoor ernstige MS-signaalonderdrukking ontstaat als het niet goed wordt geëlimineerd13.
Verschillende SDS-depletiestrategieën zijn beschikbaar voor daaropvolgende proteoomanalyse, zoals het vasthouden van eiwitten boven een moleculair gewichtsafsnijdingsfilter in wegwerpspinpatronen 14,15,16. De filterondersteunde monstervoorbereidingsmethode (FASP) heeft de voorkeur omdat het sds effectief onder 10 ppm uitput, waardoor optimale MS mogelijk wordt. Eiwitherstel met FASP is echter variabel, wat leidde tot de verkenning van andere technieken. Chromatografische benaderingen die selectief eiwitten (of oppervlakteactieve stoffen) vastleggen, zijn geëvolueerd naar verschillende handige cartridges of op kralen gebaseerde formaten 17,18,19,20,21. Gezien deze eenvoudige en (idealiter) consistente strategieën voor eiwitzuivering, wordt de klassieke benadering van eiwitprecipitatie met organische oplosmiddelen vaak over het hoofd gezien als een veelbelovende benadering van eiwitisolatie. Hoewel is aangetoond dat oplosmiddelprecipitatie SDS met succes onder kritieke niveaus uitput, is eiwitterugwinning al lang een zorg van deze aanpak. Meerdere groepen hebben een eiwitherstelbias waargenomen, met onaanvaardbaar lage neerslagopbrengsten als functie van eiwitconcentratie, molecuulgewicht en hydrofobiciteit 22,23. Vanwege de diversiteit aan neerslagprotocollen die in de literatuur worden gerapporteerd, werden gestandaardiseerde neerslagcondities ontwikkeld. In 2013 rapporteerden Crowell et al. voor het eerst de afhankelijkheid van ionische sterkte van de neerslagefficiëntie van eiwitten in 80% aceton24. Voor alle onderzochte eiwitten bleek de toevoeging van maximaal 30 mM natriumchloride essentieel om de opbrengsten te maximaliseren (tot 100% herstel). Meer recent toonden Nickerson et al. aan dat de combinatie van nog hogere ionische sterkte (tot 100 mM) met verhoogde temperatuur (20 °C) tijdens acetonprecipitatie bijna kwantitatief herstel gaf in 2-5 min25. Een lichte daling in het herstel van laagmoleculaire gewicht (LMW) eiwitten werd waargenomen. Daarom toonde een daaropvolgend rapport van Baghalabadi et al. de succesvolle terugwinning van LMW-eiwitten en peptiden (≤5 kDa) aan door specifieke zouten, met name zinksulfaat, te combineren met een hoger gehalte aan organisch oplosmiddel (97% aceton)26.
Terwijl het verfijnen van het neerslagprotocol een betrouwbaardere eiwitzuiveringsstrategie biedt voor op MS gebaseerde proteomics, is het succes van conventionele neerslag sterk afhankelijk van de gebruikerstechniek. Een primair doel van dit werk is om een robuuste precipitatiestrategie te presenteren die de isolatie van de eiwitpellet van het verontreinigende supernatant vergemakkelijkt. Een wegwerpfiltratiepatroon werd ontwikkeld om pipetteren te elimineren door geaggregeerd eiwit te isoleren boven een poreusPTFE-membraanfilter 27. MS-storende componenten in het supernatant worden effectief verwijderd in een korte, lage snelheid centrifugatiestap. Het wegwerpfilterpatroon biedt ook een verwisselbare SPE-cartridge, die het mogelijk maakt om monsters op te ruimen na resolubilisatie en optionele eiwitvertering, vóór massaspectrometrie.
Een reeks aanbevolen proteoomprecipitatieworkflows worden hier gepresenteerd, waaronder gemodificeerde aceton- en chloroform / methanol / water28-protocollen , in een conventioneel (op basis van flacons) en een semi-geautomatiseerd formaat in een wegwerp tweetoestandsfiltratie- en extractiepatroon. De resulterende eiwitterugwinningen en SDS-depletie-efficiënties worden benadrukt, samen met bottom-up LC-MS / MS-proteoomdekking, om de verwachte uitkomst van elk protocol aan te tonen. De praktische voor- en nadelen van elke aanpak worden besproken.
Optimale MS-karakterisering wordt bereikt wanneer het resterende SDS onder 10 ppm wordt uitgeput. Terwijl alternatieve benaderingen, zoals FASP en on-bead digestion, kwantitatieve SDS-uitputting bieden met variabel herstel 31,32,33, is het primaire doel van neerslag om de zuiverheid en opbrengst tegelijkertijd te maximaliseren. Dit hangt af van het effectief isoleren van het supernatant (dat de SDS bevat) zonder de eiwitkorrel t…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De auteurs bedanken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) en SPARC BioCentre (Molecular Analysis) van het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) voor hun bijdragen aan de verwerving van MS-gegevens.
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |