RNA編集の迅速な検出のためのノンシーケンシングアプローチ
Summary
ゲノム規模でのRNA編集イベントの迅速な検出と信頼性の高い定量化は依然として困難であり、現在は直接RNAシーケンシング法に依存しています。ここで説明するプロトコルは、RNA編集を検出するための簡単で迅速でポータブルな方法として、微小温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)を使用しています。
Abstract
RNA編集は、RNAにおける転写後配列変化をもたらすプロセスである。RNA編集の検出と定量は、主にサンガーシーケンシングとRNAシーケンシング技術に依存しています。ただし、これらの方法はコストと時間がかかる場合があります。このプロトコルでは、ポータブルマイクロ温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)システムが、RNA編集の迅速な検出のための非シーケンシングアプローチとして使用されます。このプロセスは電気泳動の原理に基づいており、核酸サンプルがポリアクリルアミドゲル上を移動する際に高温を使用して変性します。さまざまな温度にわたって、DNA断片は、完全に分離された二本鎖DNAから部分的に分離された鎖への勾配を形成し、次いで完全に分離された一本鎖DNAへの勾配を形成する。異なるヌクレオチド塩基を有するRNA編集部位は、μTGGE分析において異なる融解プロファイルを生成する。我々は、μTGGEベースのアプローチを使用して、4つの編集されたRNA断片とそれらに対応する非編集(野生型)断片の融解プロファイルの違いを特徴付けた。パターン類似性スコア(PaSS)は、編集されたRNAと編集されていないRNAによって生成されたバンドパターンを比較することによって計算され、方法の再現性を評価するために使用された。全体として、ここで説明するプラットフォームは、RNA中の一塩基変異でさえも、簡単でシンプルで費用対効果の高い方法で検出することを可能にします。この解析ツールは、新しい分子生物学の知見の一助となることが期待されます。
Introduction
ゲノムRNA中の一塩基変異体(SNV)は、A対I、C対U、およびU対C変異体を含むが、RNA編集事象を示し得る。しかし、RNA中のSNVの検出は依然として技術的に困難な作業である。従来、編集済みRNAと非編集RNAの比率は、直接シークエンシング、対立遺伝子特異的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または変性高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アプローチによって決定される1、2、3、4、5、6に近づく。しかし、これらのアプローチは特に時間的または費用対効果が高くなく、高レベルのノイズによって引き起こされるそれらの低い精度は、RNAベースのSNV検出の技術的ボトルネックを引き起こします7,8。ここでは、RNA編集解析への直接RNAシーケンシングアプローチの必要性を排除する代替方法として、一塩基多型(SNP)を同定するための温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)に基づくプロトコルについて説明します。
電気泳動は、生命科学実験室における生体分子の分離および分析のための好ましい方法である。TGGEは、同じサイズでありながら配列が異なる二本鎖DNA断片の分離を可能にする。この技術は、DNA断片の融解温度における配列関連の違いと、それに続く線形温度勾配9,10を有する多孔質ゲルにおけるそれらの移動度の変化に依存する。DNA断片の融解は、特異的な融解プロファイルを生成する。最も低い融解温度を有するドメインがゲル内の特定の位置で対応する温度に達すると、らせん構造から部分的に融解した構造への移行が起こり、分子の遊走は実質的に停止する。したがって、TGGEはDNA断片の移動度(サイズ情報)と温度誘起構造遷移(配列依存性情報)の両方を利用し、DNA断片の特性評価への強力なアプローチとなっています。DNA分子の3つの構造遷移に対応するTGGE融解パターンの特徴点は、鎖初期解離点、鎖中間解離点、鎖末端解離点です(図1)。ドメイン内の配列の変動は、たとえ一塩基の違いであっても、融解温度に影響を与えるため、異なる配列を持つ分子はTGGE分析において離散的な融解(変性)パターンを示します。したがって、TGGEはゲノムRNA中のSNVを分析するために使用でき、RNA編集を検出するための非常に貴重なハイスループット方法となり得る。このハイスループットゲインは、従来のゲル電気泳動ベースのTGGEを使用すると失われます。しかし、microTGGE(μTGGE)と名付けられたTGGEの小型化バージョンは、ゲル電気泳動時間を短縮し、生産性を100倍向上させて分析を加速するために使用できます11。μTGGE法のシンプルさとコンパクトさは、現場で適用可能なハンドヘルドで手頃な価格のゲル電気泳動システムであるPalmPAGE12の導入によって改善されました。
ここでは、新しいTGGEベースのプロトコルを使用して、 シロイヌナズナ 組織からの2つと哺乳動物のHEK293細胞で発現された2つを含む4つの遺伝子における3種類のRNA編集部位(A-to-I、C-to-U、およびU-to-C)を調べる。このプロトコルは、RNA編集の迅速な検出のためのポータブルシステムであるPalmPAGE(ハードウェア)とuMelt(ソフトウェア)の使用を統合しています13。平均実行時間は 15 ~ 30 分で、このプロトコルは、直接 RNA シーケンシングアプローチを必要とせずに、RNA 編集の迅速で信頼性が高く、簡単な識別を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA編集は生物学において重要な役割を果たします。しかし、クロマトグラフィーやシーケンシングなどの現在の RNA 編集の検出方法は、コストが高く、時間要件が大きすぎ、複雑さが増すため、いくつかの課題があります。ここで説明するプロトコルは、ポータブルでマイクロサイズのTGGEベースのシステムを使用する、RNA編集を検出するためのシンプルで迅速で費用対効果の高い方法です。?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金(17H02204, 18K19288)の助成を受けて行われました。ルチカは日本政府(文部科学省奨学金)の資金援助を受けていました。ラディカ・ビヤニ氏(JAIST高木研究室)とキルティ・シャルマ博士(バイオシーズ株式会社)に電気泳動関連の実験に協力していただき、誠にありがとうございます。
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
Referencias
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