RNA Düzenlemenin Hızlı Tespiti için Dizilemesiz Bir Yaklaşım
Summary
RNA düzenleme olaylarının genomik ölçekte hızlı tespiti ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zorlu olmaya devam etmektedir ve şu anda doğrudan RNA dizileme yöntemlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol, RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve taşınabilir bir yöntem olarak mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) kullanır.
Abstract
RNA düzenleme, RNA’larda posttranskripsiyonel dizi değişikliklerine yol açan bir süreçtir. RNA düzenlemenin tespiti ve nicelleştirilmesi esas olarak Sanger dizileme ve RNA dizileme tekniklerine dayanır. Ancak, bu yöntemler maliyetli ve zaman alıcı olabilir. Bu protokolde, RNA düzenlemenin hızlı tespiti için sıralanmamış bir yaklaşım olarak taşınabilir bir mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) sistemi kullanılmaktadır. Proses, bir poliakrilamid jel üzerinde hareket ederken nükleik asit numunelerini denatüre etmek için yüksek sıcaklıklar kullanan elektroforez prensibine dayanmaktadır. Bir dizi sıcaklık boyunca, bir DNA fragmanı, kısmen ayrılmış iplikçiklere ve daha sonra tamamen ayrılmış tek sarmallı DNA’ya tamamen çift sarmallı DNA’nın bir gradyanını oluşturur. Farklı nükleotid bazlarına sahip RNA tarafından düzenlenmiş bölgeler, μTGGE analizlerinde farklı erime profilleri üretir. Dört düzenlenmiş RNA fragmanının erime profilleri ile bunlara karşılık gelen düzenlenmemiş (vahşi tip) fragmanlar arasındaki farkları karakterize etmek için μTGGE tabanlı yaklaşımı kullandık. Örüntü Benzerlik Puanları (PaSS’ler), düzenlenmiş ve düzenlenmemiş RNA’lar tarafından üretilen bant desenleri karşılaştırılarak hesaplandı ve yöntemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. Genel olarak, burada açıklanan platform, RNA’lardaki tek baz mutasyonlarının bile basit, basit ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu analiz aracının yeni moleküler biyoloji bulgularına yardımcı olacağı öngörülmektedir.
Introduction
A-to-I, C-to-U ve U-to-C varyantları dahil olmak üzere genomik RNA’daki tek nükleotid varyantları (SNV’ler), RNA düzenleme olaylarını gösterebilir. Bununla birlikte, RNA’daki SNV’lerin tespiti teknik olarak zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Geleneksel olarak, düzenlenmiş RNA’nın düzenlenmemiş RNA’ya oranı, doğrudan dizileme, alele özgü gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya denatüre edici yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yaklaşımları 1,2,3,4,5,6 ile belirlenir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar özellikle zaman veya maliyet açısından etkili değildir ve yüksek gürültü seviyelerinin neden olduğu düşük doğrulukları, RNA tabanlı SNV tespiti 7,8 için teknolojik darboğazlar oluşturmaktadır. Burada, RNA düzenleme analizlerine doğrudan RNA dizileme yaklaşımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldıran alternatif bir yöntem olarak tek nükleotid polimorfizmlerini (SNP’ler) tanımlamak için sıcaklık gradyanı jel elektroforezine (TGGE) dayanan bir protokol tanımlamaktayız.
Elektroforez, yaşam bilimleri laboratuvarlarında biyomoleküllerin ayrılması ve analizi için tercih edilen bir yöntemdir. TGGE, aynı boyutta ancak farklı dizilere sahip çift sarmallı DNA parçalarının ayrılmasını sağlar. Teknik, DNA fragmanlarının erime sıcaklıklarındaki diziye bağlı farklılıklara ve doğrusal sıcaklık gradyanı 9,10 olan gözenekli jellerdeki hareketliliklerindeki müteakip değişikliklere dayanır. DNA fragmanlarının erimesi, spesifik erime profilleri oluşturur. En düşük erime sıcaklığına sahip alan, jeldeki belirli bir konumda karşılık gelen sıcaklığa ulaştığında, sarmal bir yapıdan kısmen erimiş bir yapıya geçiş gerçekleşir ve molekülün göçü pratik olarak durur. Bu nedenle, TGGE, DNA fragmanlarının (diziye bağlı bilgi) hem hareketliliğini (boyut bilgisi) hem de sıcaklık kaynaklı yapısal geçişlerini kullanır ve bu da onu DNA parçalarının karakterizasyonuna güçlü bir yaklaşım haline getirir. DNA molekülünün üç yapısal geçişine karşılık gelen TGGE erime modelindeki özellik noktaları, iplik başlangıç-ayrışma noktası, iplik orta-ayrışma noktası ve iplik sonu ayrışma noktasıdır (Şekil 1). Etki alanları içindeki dizi değişimleri, hatta tek baz farklılıkları bile, erime sıcaklığını etkiler, bu nedenle, farklı dizilere sahip moleküller, TGGE analizlerinde ayrık erime (denatürasyon) kalıpları gösterecektir. Bu nedenle, TGGE, genomik RNA’daki SNV’leri analiz etmek için kullanılabilir ve RNA düzenlemesini tespit etmek için paha biçilmez bir yüksek verimli yöntem olabilir. Bu yüksek verimli kazanç, geleneksel jel elektroforez bazlı TGGE kullanıldığında kaybolur. Bununla birlikte, TGGE’nin microTGGE (μTGGE) adı verilen minyatür bir versiyonu, jel elektroforetik süresini kısaltmak ve verimlilikte 100 kat artışla analizi hızlandırmak için kullanılabilir11. μTGGE yönteminin basitliği ve kompaktlığı, sahaya uygun, elde taşınabilen ve uygun fiyatlı bir jel elektroforez sistemi olan PalmPAGE12’nin piyasaya sürülmesiyle geliştirilmiştir.
Burada, ikisi Arabidopsis thaliana dokularından ve ikisi memeli HEK293 hücrelerinde eksprese edilen dört gende üç tip RNA düzenleme bölgesini (A-to-I, C-to-U ve U-to-C) incelemek için yeni bir TGGE tabanlı protokol kullanılmaktadır (Şekil 1A). Protokol, RNA düzenlemenin hızlı tespiti için taşınabilir bir sistem olan PalmPAGE (donanım) ve uMelt (yazılım)13 kullanımını entegre eder. Ortalama 15-30 dakikalık çalışma süresine sahip olan bu protokol, doğrudan RNA dizileme yaklaşımlarına gerek kalmadan RNA düzenlemenin hızlı, güvenilir ve kolay bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA düzenleme biyolojide önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, kromatografi ve dizileme gibi RNA düzenlemesini tespit etmenin mevcut yöntemleri, yüksek maliyetleri, aşırı zaman gereksinimleri ve karmaşıklıkları nedeniyle çeşitli zorluklar ortaya koymaktadır. Burada açıklanan protokol, taşınabilir, mikrosifik, TGGE tabanlı bir sistem kullanan RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu sistem, Sanger diziliminden önce düzenlenmiş ve düzenlenmemiş ge…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği’nden (17H02204 ve 18K19288) Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid tarafından desteklenmiştir. Ruchika, Japon hükümeti tarafından finansal olarak desteklendi (MEXT bursu). Bayan Radhika Biyani’ye (Takagi Laboratuvarı, JAIST) ve Dr. Kirti Sharma’ya (BioSeeds Corporation) elektroforezle ilgili deneylerdeki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
Referencias
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
