Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN
Summary
La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.
Abstract
La edición de ARN es un proceso que conduce a alteraciones de la secuencia posttranscripcional en los ARN. La detección y cuantificación de la edición de ARN se basa principalmente en la secuenciación de Sanger y las técnicas de secuenciación de ARN. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y llevar mucho tiempo. En este protocolo, se utiliza un sistema portátil de electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN. El proceso se basa en el principio de electroforesis, que utiliza altas temperaturas para desnaturalizar muestras de ácido nucleico a medida que se mueven a través de un gel de poliacrilamida. A través de un rango de temperaturas, un fragmento de ADN forma un gradiente de ADN de doble cadena a hebras parcialmente separadas y luego a ADN de cadena simple completamente separado. Los sitios editados por ARN con distintas bases de nucleótidos producen diferentes perfiles de fusión en los análisis de μTGGE. Utilizamos el enfoque basado en μTGGE para caracterizar las diferencias entre los perfiles de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados (tipo salvaje). Las puntuaciones de similitud de patrones (PaSS) se calcularon comparando los patrones de banda producidos por los ARN editados y no editados y se utilizaron para evaluar la reproducibilidad del método. En general, la plataforma descrita aquí permite la detección de mutaciones incluso de base única en ARN de una manera directa, simple y rentable. Se prevé que esta herramienta de análisis ayudará a nuevos hallazgos de biología molecular.
Introduction
Las variantes de nucleótido único (SNV) en el ARN genómico, incluidas las variantes de A a I, C a U y U a C, pueden indicar eventos de edición de ARN. Sin embargo, la detección de SNVs en el ARN sigue siendo una tarea técnicamente desafiante. Convencionalmente, la proporción de ARN editado a no editado se determina mediante secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real específica del alelo o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de desnaturalización 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques no son particularmente efectivos en tiempo o costo, y sus bajas precisiones, causadas por altos niveles de ruido, plantean cuellos de botella tecnológicos para la detección de SNV basada en ARN 7,8. Aquí, describimos un protocolo basado en la electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como un método alternativo que elimina la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN para los análisis de edición de ARN.
La electroforesis es un método preferido para la separación y el análisis de biomoléculas en laboratorios de ciencias de la vida. TGGE permite la separación de fragmentos de ADN de doble cadena que son del mismo tamaño pero tienen diferentes secuencias. La técnica se basa en las diferencias relacionadas con la secuencia en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN y los cambios posteriores en sus movilidades en geles porosos con un gradiente de temperatura lineal 9,10. La fusión de fragmentos de ADN genera perfiles de fusión específicos. Una vez que el dominio con la temperatura de fusión más baja alcanza la temperatura correspondiente en una posición particular en el gel, se produce la transición de una estructura helicoidal a una estructura parcialmente fundida, y la migración de la molécula prácticamente se detendrá. Por lo tanto, TGGE utiliza tanto la movilidad (información de tamaño) como las transiciones estructurales inducidas por la temperatura de los fragmentos de ADN (información dependiente de la secuencia), lo que lo convierte en un enfoque poderoso para la caracterización de fragmentos de ADN. Los puntos característicos en un patrón de fusión TGGE, que corresponden a tres transiciones estructurales de la molécula de ADN, son el punto de disociación inicial de la hebra, el punto de disociación media de la hebra y el punto de disociación final de la hebra (Figura 1). Las variaciones de secuencia dentro de los dominios, incluso las diferencias de una sola base, afectan la temperatura de fusión, por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias mostrarán patrones discretos de fusión (desnaturalización) en los análisis TGGE. Por lo tanto, TGGE se puede utilizar para analizar SNV en ARN genómico y puede ser un método invaluable de alto rendimiento para detectar la edición de ARN. Esta ganancia de alto rendimiento se pierde cuando se utiliza TGGE tradicional basado en electroforesis en gel. Sin embargo, una versión miniaturizada de TGGE, llamada microTGGE (μTGGE), se puede utilizar para acortar el tiempo electroforético del gel y acelerar el análisis con un aumento de 100 veces en la productividad11. La simplicidad y la compacidad del método μTGGE se han mejorado con la introducción de PalmPAGE12, un sistema de electroforesis en gel aplicable en el campo, portátil y asequible.
Aquí, se utiliza un nuevo protocolo basado en TGGE para examinar tres tipos de sitios de edición de ARN (A-to-I, C-to-U y U-to-C) en cuatro genes, incluidos dos de tejidos de Arabidopsis thaliana y dos expresados en células HEK293 de mamíferos (Figura 1A). El protocolo integra el uso de PalmPAGE (hardware), un sistema portátil para la detección rápida de la edición de ARN, y uMelt (software)13. Con un tiempo de ejecución promedio de 15-30 min, este protocolo permite una identificación rápida, confiable y fácil de la edición de ARN sin la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
La edición de ARN juega un papel importante en la biología; sin embargo, los métodos actuales de detección de edición de ARN, como la cromatografía y la secuenciación, presentan varios desafíos debido a su alto costo, requisitos de tiempo excesivos y complejidad. El protocolo descrito aquí es un método simple, rápido y rentable para detectar la edición de ARN que utiliza un sistema portátil, de tamaño micrométrico y basado en TGGE. Este sistema se puede utilizar para diferenciar entre genes editados y no e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H02204 y 18K19288). Ruchika fue apoyada financieramente por el gobierno japonés (beca MEXT). Agradecemos a la Sra. Radhika Biyani (Laboratorio Takagi, JAIST) y al Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por su ayuda con los experimentos relacionados con la electroforesis.
Materials
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
Referencias
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O’Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
