Meting van endotheelafhankelijke vasorelaxatie in de thoracale aorta van de muis met behulp van tensometrische kamermyografie met klein volume
Summary
Het huidige protocol beschrijft de concepten en technische toepassing van de tensometrische myograaftechniek met behulp van een meerkamermyograafsysteem in de experimentele ex vivo beoordeling van de aorta-endotheelfunctie van muizen.
Abstract
Tensometrische myografie met een kleine volumekamer is een veelgebruikte techniek om de vasculaire contractiliteit van kleine en grote bloedvaten bij proefdieren en kleine slagaders geïsoleerd uit menselijk weefsel te evalueren. De techniek stelt onderzoekers in staat om geïsoleerde bloedvaten te behouden in een strak gecontroleerde en gestandaardiseerde (bijna-fysiologische) omgeving, met de mogelijkheid om zich aan te passen aan verschillende omgevingsfactoren, terwijl ze de geïsoleerde bloedvaten uitdagen met verschillende farmacologische middelen die vasoconstrictie of vaatverwijding kunnen induceren. De myograafkamer biedt ook een platform om vasculaire reactiviteit te meten als reactie op verschillende hormonen, remmers en agonisten die de functie van gladde spieren en endotheellagen afzonderlijk of tegelijkertijd kunnen beïnvloeden. De bloedvatwand is een complexe structuur die bestaat uit drie verschillende lagen: de intima (endotheellaag), media (gladde spier- en elastinevezels) en adventitia (collageen en ander bindweefsel). Om een duidelijk inzicht te krijgen in de functionele eigenschappen van elke laag, is het van cruciaal belang om toegang te hebben tot een experimenteel platform en systeem dat een gecombineerde benadering mogelijk maakt om alle drie de lagen tegelijkertijd te bestuderen. Een dergelijke benadering vereist toegang tot een semi-fysiologische toestand die de in vivo omgeving in een ex vivo omgeving zou nabootsen. Tensometrische myografie met kleine volumes heeft een ideale omgeving geboden om de impact van omgevingssignalen, experimentele variabelen of farmacologische agonisten en antagonisten op vasculaire eigenschappen te evalueren. Al vele jaren gebruiken wetenschappers de tensometrische myograaftechniek om de endotheelfunctie en gladde spiercontractiliteit te meten als reactie op verschillende middelen. In dit rapport wordt een tensometrisch myometrisch myograafsysteem met een kleine volumekamer gebruikt om de endotheelfunctie in de geïsoleerde muisaorta te meten. Dit rapport richt zich op hoe tensometrische myografie van de small volume chamber kan worden gebruikt om de functionele integriteit van het endotheel in kleine segmenten van een grote slagader zoals de thoracale aorta te evalueren.
Introduction
De laatste decennia is het kleine kamermyografiesysteem gebruikt om de reactiviteit van verschillende lagen bloedvatwanden te meten als reactie op verschillende farmacologische middelen en neurotransmitters in een ex vivo, real-time setting. Vasculaire reactiviteit is een belangrijk onderdeel van een gezond functioneel bloedvat en is van cruciaal belang voor de regulatie van de bloedstroom en perfusie in perifere en cerebrale vasculatuur1. Binnen de bloedvatwand is de interactie tussen endotheel- en gladde spierlagen een belangrijke determinant van de vasculaire tonus, die ook voortdurend wordt beïnvloed door structurele veranderingen in de bindweefsellaag rond de bloedvatwand (adventitia).
De endotheellaag regelt vasomotie door een paar vaatverwijdende factoren vrij te geven, waaronder stikstofmonoxide (NO), prostacycline (BGA2) en van endotheel afgeleide hyperpolariserende factor (EDHF), of door vasoconstrictieve middelen zoals endotheline-1 (ET-1) en tromboxaan (TXA2)2,3,4 te produceren. Onder deze factoren is NO uitgebreid bestudeerd en de belangrijke regulerende rollen in andere kritieke cellulaire functies zoals ontsteking, migratie, overleving en proliferatie zijn sterk geciteerd in de wetenschappelijke literatuur 2,5.
Op het gebied van vasculaire biologie heeft kamermyografie vasculaire fysiologen en farmacologen een waardevol en betrouwbaar hulpmiddel geboden om de endotheelfunctie te meten in een strak gecontroleerd semi-fysiologisch systeem1. Momenteel zijn er twee verschillende myograafsystemen beschikbaar voor wetenschappers: draad (of pin) tensometrische (isometrische) myografie en drukmyografie. In een draadmyografiesysteem wordt het bloedvat uitgerekt tussen twee draden of pinnen, waardoor de isometrische meting van kracht- of spanningsontwikkeling in de wand van het bloedvat mogelijk is, terwijl drukmyografie een voorkeursplatform is voor metingen van vasculaire reactiviteit in kleine weerstandsslagaders, waar veranderingen in bloeddruk worden beschouwd als de belangrijkste stimulans voor veranderingen in vasculaire tonus en vasomotion. Er is een algemene overeenstemming dat, voor kleine weerstandsslagaders zoals mesenteriale en cerebrale slagaders, drukmyografie een aandoening creëert die dichter bij de fysiologische omstandigheden in het menselijk lichaam ligt. De kleine kamermyograaf kan worden gebruikt voor vaten met zeer kleine diameters (200-500 μm) tot veel grotere vaten zoals de aorta.
Hoewel de draadmyograaf een krachtig systeem is voor het registreren van de spanning van bloedvaten onder isometrische omstandigheden, is de drukmyograaf een geschikter systeem voor het meten van veranderingen in de diameter van het vat als reactie op veranderingen in isobare omstandigheden. De diameterveranderingen in het vat als reactie op veranderingen in druk of stroming zijn veel groter in een kleine spierslagader (arteriole) in vergelijking met grote elastische slagaders zoals de aorta. Om deze redenen wordt de drukmyograaf beschouwd als een beter hulpmiddel voor kleine bloedvaten met aanzienlijke vasoreactiviteit1. Een van de andere praktische sterke punten van multi-kamer tensometrische myografie met kleine volumekamers is dat men de bijdrage van verschillende mechanismen aan vasculaire reactiviteit kan onderscheiden door meerdere (maximaal vier) segmenten van dezelfde slagader en van hetzelfde dier te bestuderen om variabiliteit te verminderen en robuuste en sluitende gegevens te produceren. Het is ook relatief eenvoudig technisch in te stellen en te onderhouden. Vaten van bijna elke grootte kunnen worden bestudeerd met een draadmyograaf. Het is een meer kosteneffectieve oplossing voor het beoordelen van de vasculaire functie en is een goed alternatief voor drukmyografie in experimenten waarbij de lengte van het ontlede vat te kort is voor het drukmyograafprotocol.
Dit rapport biedt een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van de endotheelfunctie in de geïsoleerde thoracale aortaring van muizen met behulp van montagepennen in de tensometrische myografietechniek van de kleine volumekamer met behulp van het DMT-620 multikamer myograafsysteem (DMT-USA). Dit protocol maakt gebruik van een 6 maanden oude mannelijke C57BL6-muis met een gemiddeld gewicht tussen 25-35 g. Gelukkig kan dit protocol worden toegepast op verschillende diertypen en gewichten, gezien het brede scala aan scheepstypen en diameters waarvoor dit protocol kan worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebied van vasculaire biologie is sterk afhankelijk van hulpmiddelen die onderzoekers helpen de functionele en structurele integriteit van de bloedvatwand te beoordelen. Het vraagt ook speciale aandacht voor de directe en indirecte interacties tussen de drie lagen van bloedvaten: de intima, media en adventitia. Onder die drie lagen wordt de intima gevormd door een monolaag van endotheelcellen en heeft een zeer belangrijke functie bij het reguleren van vasculaire gezondheid en hemostase.
He…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R15HL145646) en Midwestern University College of Graduate Studies.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
Referencias
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
