Fare Torasik Aortunda Endotele Bağlı Vazogevşemenin Tensometrik Küçük Hacimli Oda Miyografisi ile Ölçülmesi
Summary
Bu protokol, fare aort endotel fonksiyonunun deneysel ex vivo değerlendirmesinde çok odacıklı bir miyograf sistemi kullanılarak tensometrik miyograf tekniğinin kavramlarını ve teknik uygulamasını açıklamaktadır.
Abstract
Küçük hacimli kamara tensometrik miyografi, laboratuvar hayvanlarında ve insan dokusundan izole edilen küçük arterlerde küçük ve büyük kan damarlarının vasküler kontraktilitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu teknik, araştırmacıların izole kan damarlarını sıkı bir şekilde kontrol edilen ve standartlaştırılmış (fizyolojik) bir ortamda, çeşitli çevresel faktörlere uyum sağlama seçeneğiyle korumalarını sağlarken, izole edilmiş damarlara vazokonstriksiyon veya vazodilatasyona neden olabilecek farklı farmakolojik ajanlarla meydan okur. Miyograf odası ayrıca, düz kas ve endotel katmanlarının işlevini ayrı ayrı veya aynı anda etkileyebilecek çeşitli hormonlara, inhibitörlere ve agonistlere yanıt olarak vasküler reaktiviteyi ölçmek için bir platform sağlar. Kan damarı duvarı üç farklı tabakadan oluşan karmaşık bir yapıdır: intima (endotel tabakası), media (düz kas ve elastin lifleri) ve adventiti (kollajen ve diğer bağ dokusu). Her katmanın işlevsel özelliklerini net bir şekilde anlamak için, üç katmanı aynı anda incelemek için kombinasyonel bir yaklaşıma izin verecek deneysel bir platforma ve sisteme erişebilmek çok önemlidir. Böyle bir yaklaşım, ex vivo bir ortamda in vivo ortamı taklit edecek yarı fizyolojik bir duruma erişim gerektirir. Küçük hacimli kamara tensometrik miyografi, çevresel ipuçlarının, deneysel değişkenlerin veya farmakolojik agonist ve antagonistlerin vasküler özellikler üzerindeki etkisini değerlendirmek için ideal bir ortam sağlamıştır. Uzun yıllar boyunca, bilim adamları farklı ajanlara yanıt olarak endotel fonksiyonunu ve düz kas kontraktilitesini ölçmek için tensometrik miyograf tekniğini kullandılar. Bu yazıda, izole fare aortunda endotel fonksiyonunu ölçmek için küçük hacimli odacıklı tensometrik miyograf sistemi kullanılmıştır. Bu rapor, torasik aort gibi büyük bir arterin küçük segmentlerinde endotelin fonksiyonel bütünlüğünü değerlendirmek için küçük hacimli kamara tensometrik miyografinin nasıl kullanılabileceğine odaklanmaktadır.
Introduction
Son birkaç on yıldır, küçük oda miyografi sistemi, ex vivo, gerçek zamanlı bir ortamda çeşitli farmakolojik ajanlara ve nörotransmitterlere yanıt olarak farklı kan damarı duvarlarının reaktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Vasküler reaktivite, sağlıklı bir fonksiyonel kan damarının önemli bir bileşenidir ve periferik ve serebral vaskülatür 1’de kan akışının ve perfüzyonun düzenlenmesi için kritiköneme sahiptir. Kan damarı duvarı içinde, endotel ve düz kas katmanları arasındaki etkileşim, kan damarı duvarını çevreleyen bağ dokusu tabakasındaki yapısal değişikliklerden (adventitia) sürekli olarak etkilenen vasküler tonusun önemli bir belirleyicisidir.
Endotel tabakası, nitrik oksit (NO), prostasiklin (PGI2) ve endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF) dahil olmak üzere birkaç vazodilatatör faktörü serbest bırakarak veya endotelin-1 (ET-1) ve tromboksan (TXA2) 2,3,4 gibi vazokonstrüktif ajanlar üreterek vazohareketi kontrol eder. Bu faktörler arasında, NO’nun kapsamlı bir şekilde çalışıldığı ve inflamasyon, göç, sağkalım ve proliferasyon gibi diğer kritik hücresel fonksiyonlardaki önemli düzenleyici rolleri bilimsel literatürde yüksek oranda belirtilmiştir 2,5.
Vasküler biyoloji alanında, oda miyografisi, vasküler fizyologlara ve farmakologlara, sıkı bir şekilde kontrol edilen yarı fizyolojik sistemde endotel fonksiyonunu ölçmek için değerli ve güvenilir bir araç sağlamıştır1. Şu anda, bilim adamları için iki farklı miyograf sistemi vardır: tel (veya iğne) tensometrik (izometrik) miyografi ve basınç miyografisi. Bir tel miyografi sisteminde, kan damarı iki tel veya pim arasında gerilir, bu da kan damarının duvarındaki kuvvet veya gerginlik gelişiminin izometrik ölçümüne izin verirken, basınç miyografisi, kan basıncındaki değişikliklerin vasküler ton ve vazohareketteki değişiklikler için ana uyaran olarak kabul edildiği küçük dirençli arterlerde vasküler reaktivite ölçümleri için tercih edilen bir platformdur. Mezenterik ve serebral arterler gibi küçük dirençli arterler için, basınç miyografisinin insan vücudundaki fizyolojik koşullara daha yakın bir durum yarattığı konusunda genel bir anlaşma vardır. Küçük odacıklı miyograf, aort gibi çok küçük çaplara (200-500 μm) sahip damarlar için kullanılabilir.
Tel miyograf, izometrik koşullar altında kan damarı gerginliğini kaydetmek için güçlü bir sistem olsa da, basınçlı miyograf, izobarik koşullardaki değişikliklere yanıt olarak damar çapındaki değişiklikleri ölçmek için daha uygun bir sistemdir. Basınç veya akıştaki değişikliklere yanıt olarak damardaki çap değişiklikleri, küçük bir kaslı arterde (arteriol) aort gibi büyük elastik arterlere kıyasla çok daha büyüktür. Bu nedenlerden dolayı, basınçlı miyograf, önemli vazoreaktivite1’e sahip küçük kan damarları için daha iyi bir araç olarak kabul edilir. Çok odacıklı küçük hacimli odacıklı tensometrik miyografinin diğer pratik güçlerinden biri, değişkenliği azaltmak ve sağlam ve kesin veriler üretmek için aynı arterin ve aynı hayvanın birden fazla (dörde kadar) segmentini inceleyerek farklı mekanizmaların vasküler reaktiviteye katkısını ayırt edebilmesidir. Teknik olarak kurulumu ve bakımı da nispeten kolaydır. Hemen hemen her büyüklükteki damarlar bir tel miyograf ile incelenebilir. Vasküler fonksiyonun değerlendirilmesi için daha uygun maliyetli bir çözümdür ve disseke edilen damarın uzunluğunun basınçlı miyograf protokolü için çok kısa olduğu deneylerde basınç miyografisine iyi bir alternatiftir.
Bu raporda, DMT-620 çok odacıklı miyograf sistemi (DMT-USA) kullanılarak küçük hacimli kamaralı tensometrik miyografi tekniğindeki montaj pimleri kullanılarak izole fare torasik aort halkasındaki endotel fonksiyonunun değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, ortalama ağırlığı 25-35 g arasında olan 6 aylık bir erkek C57BL6 fare kullanır. Neyse ki, bu protokol, bu protokolün kullanılabileceği çok çeşitli damar tipleri ve çapları göz önüne alındığında, çeşitli hayvan türlerine ve ağırlıklarına uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vasküler biyoloji alanı, araştırmacıların kan damarı duvarının fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü değerlendirmelerine yardımcı olan araçlara büyük ölçüde dayanmaktadır. Ayrıca, üç kan damarı katmanı arasındaki doğrudan ve dolaylı etkileşimlere özel dikkat gösterilmesini gerektirir: intima, medya ve adventitia. Bu üç katman arasında intima, endotel hücrelerinin tek katmanından oluşur ve vasküler sağlığı ve hemostazı düzenlemede çok önemli bir işleve sahiptir.
<p cla…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R15HL145646) ve Midwestern Üniversitesi Lisansüstü Çalışmalar Koleji’nin finansmanıyla desteklenmiştir.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
Referencias
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
