テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定
Summary
本プロトコルは、マウス大動脈内皮機能の実験的 ex vivo 評価におけるマルチチャンバーミオグラフシステムを用いたテンソメトリックミオグラフ技術の概念および技術的適用を記載する。
Abstract
小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィは、実験動物およびヒト組織から分離された小動脈の小血管および大血管の血管収縮性を評価するために一般的に使用される技術です。この技術により、研究者は、血管収縮または血管拡張を誘発する可能性のあるさまざまな薬理学的物質で孤立した血管に挑戦しながら、さまざまな環境要因に適応するオプションを使用して、厳密に制御および標準化された(生理学的に近い)設定で孤立した血管を維持することができます。ミオグラフチャンバーはまた、平滑筋および内皮層の機能に別個または同時に影響を与える可能性のある様々なホルモン、阻害剤、およびアゴニストに応答して血管反応性を測定するためのプラットフォームを提供する。血管壁は、内膜(内皮層)、中膜(平滑筋およびエラスチン線維)、外膜(コラーゲンおよび他の結合組織)の3つの異なる層からなる複雑な構造である。各層の機能特性を明確に理解するには、3つの層すべてを同時に研究するための組み合わせアプローチを可能にする実験プラットフォームとシステムにアクセスすることが重要です。そのようなアプローチは、ex vivo設定におけるin vivo環境を模倣するであろう半生理学的状態へのアクセスを要求する。小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィは、血管特性に対する環境手がかり、実験変数、または薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストの影響を評価するための理想的な環境を提供してきました。長年にわたり、科学者たちはテンソメトリックミオグラフ技術を使用して、さまざまな薬剤に応答して内皮機能と平滑筋収縮性を測定してきました。本報告では、小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフシステムを使用して、単離されたマウス大動脈の内皮機能を測定します。このレポートは、胸部大動脈などの大きな動脈の小さなセグメントにおける内皮の機能的完全性を評価するために、小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィーをどのように使用できるかに焦点を当てています。
Introduction
過去数十年にわたり、小チャンバー筋電図システムは、 ex vivoのリアルタイム設定で、さまざまな薬理学的物質および神経伝達物質に応答して血管壁のさまざまな層の反応性を測定するために使用されてきました。血管反応性は、健康な機能的血管の主要成分であり、末梢および脳血管系の血流および灌流の調節に重要です1。血管壁内では、内皮層と平滑筋層の間の相互作用が血管緊張の主要な決定要因であり、血管壁(外膜)を取り巻く結合組織層の構造変化によっても常に影響を受けます。
内皮層は、一酸化窒素(NO)、プロスタサイクリン(PGI2)、内皮由来過分極因子(EDHF)などのいくつかの血管拡張因子を放出するか、エンドセリン-1(ET-1)やトロンボキサン(TXA2)などの血管収縮薬を産生することによって血管運動を制御します2,3,4。これらの要因の中で、NOは広く研究されており、炎症、遊走、生存、増殖などの他の重要な細胞機能におけるその重要な調節的役割は、科学文献で非常に引用されています2,5。
血管生物学の分野では、チャンバーミオグラフィは、血管生理学者および薬理学者に、厳密に制御された半生理学的システムにおける内皮機能を測定するための貴重で信頼性の高いツールを提供してきました1。現在、科学者が利用できる2つの異なる筋電視システムがあります:ワイヤー(またはピン)テンソメトリック(等尺性)筋電視と圧力筋図。ワイヤー筋電図システムでは、血管が2本のワイヤーまたはピンの間に引き伸ばされ、血管壁の力または張力の発達の等尺性測定が可能になりますが、圧力筋電図は、血圧の変化が血管緊張および血管運動の変化の主な刺激と見なされる小さな抵抗動脈における血管反応性の測定に適したプラットフォームです。腸間膜動脈や脳動脈などの小さな抵抗動脈の場合、圧迫筋電図検査は人体の生理学的条件に近い状態を作り出すという一般的な合意があります。小室筋計は、非常に小さな直径(200〜500μm)の血管から大動脈などのはるかに大きな血管に利用できます。
ワイヤーミオグラフが等尺性条件下で血管の張力を記録するための強力なシステムであるのに対し、圧力ミオグラフは等圧条件の変化に応じた血管径の変化を測定するためのより適切なシステムです。圧力または流れの変化に応じた血管の直径変化は、大動脈などの大きな弾性動脈と比較して、小さな筋肉動脈(細動脈)ではるかに大きくなります。これらの理由から、圧力筋計は、実質的な血管活性を有する小血管のためのより良いツールと考えられています1。マルチチャンバー小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィの他の実用的な強みの1つは、同じ動脈の複数の(最大4つの)セグメントを研究し、同じ動物から変動を減らし、堅牢で決定的なデータを生成することにより、血管反応性に対するさまざまなメカニズムの寄与を識別できることです。また、技術的にセットアップと保守も比較的簡単です。ほとんどすべてのサイズの血管は、ワイヤー筋グラフで研究することができます。これは、血管機能を評価するためのより費用効果の高いソリューションであり、解剖された血管の長さが圧力筋電視プロトコルに対して短すぎる実験における圧力筋電図の優れた代替手段です。
このレポートは、DMT-620マルチチャンバーミオグラフシステム(DMT-USA)を使用した小容量チャンバーテンソメトリックミオグラフィ技術の取り付けピンを使用して、孤立したマウス胸部大動脈リングの内皮機能を評価するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、平均体重が25〜35 gの生後6か月のオスのC57BL6マウスを利用します。幸いなことに、このプロトコルは、このプロトコルを使用できる幅広い血管の種類と直径を考慮すると、さまざまな動物の種類と体重に適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
血管生物学の分野は、研究者が血管壁の機能的および構造的完全性を評価するのに役立つツールに大きく依存しています。また、血管の3つの層(内膜、中膜、外膜)間の直接的および間接的な相互作用にも特別な注意が必要です。これらの3つの層のうち、内膜は内皮細胞の単層によって形成され、血管の健康と止血を調節する上で非常に重要な機能を持っています。
内皮?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R15HL145646)および中西部大学大学院大学からの資金提供によって支援されました。
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
Referencias
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