מדידה של כלי דם תלויי אנדותל באבי העורקים החזי של העכבר באמצעות מיוגרפיה של תא נפח קטן טנסומטרי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המושגים והיישום הטכני של טכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית באמצעות מערכת מיוגרף רב-תאית בהערכת ex vivo ניסיונית של תפקוד אנדותל אבי העורקים של עכבר.
Abstract
מיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן היא טכניקה נפוצה להערכת התכווצות כלי הדם של כלי דם קטנים וגדולים בחיות מעבדה ובעורקים קטנים המבודדים מרקמה אנושית. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לשמור על כלי דם מבודדים בסביבה מבוקרת וסטנדרטית היטב (כמעט פיזיולוגית), עם אפשרות להתאמה לגורמים סביבתיים שונים, תוך קריאת תיגר על כלי הדם המבודדים עם חומרים פרמקולוגיים שונים שיכולים לגרום להתכווצות כלי דם או להרחבת כלי דם. תא המיוגרף מספק גם פלטפורמה למדידת תגובתיות כלי הדם בתגובה להורמונים, מעכבים ואגוניסטים שונים שעשויים להשפיע על תפקוד שכבות השריר החלק והאנדותל בנפרד או בו זמנית. דופן כלי הדם היא מבנה מורכב המורכב משלוש שכבות שונות: האינטימה (שכבת האנדותל), המדיה (שריר חלק וסיבי אלסטין) ואדוונטיטיה (קולגן ורקמות חיבור אחרות). כדי לקבל הבנה ברורה של התכונות הפונקציונליות של כל שכבה, חיוני שתהיה גישה לפלטפורמה ומערכת ניסיונית שתאפשר גישה משולבת לחקר כל שלוש השכבות בו זמנית. גישה כזו דורשת גישה למצב פיזיולוגי למחצה המחקה את סביבת ה- in vivo בסביבה ex vivo . מיוגרפיה טנסומטרית של תאים קטנים סיפקה סביבה אידיאלית להערכת ההשפעה של רמזים סביבתיים, משתנים ניסיוניים או אגוניסטים ואנטגוניסטים פרמקולוגיים על תכונות כלי הדם. במשך שנים רבות, מדענים השתמשו בטכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית כדי למדוד את תפקוד האנדותל ואת התכווצות השרירים החלקים בתגובה לגורמים שונים. בדו”ח זה, מערכת מיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן משמשת למדידת תפקוד האנדותל באבי העורקים של העכבר המבודד. דו”ח זה מתמקד באופן שבו ניתן להשתמש במיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן כדי להעריך את השלמות התפקודית של האנדותל במקטעים קטנים של עורק גדול כגון אבי העורקים החזי.
Introduction
במשך העשורים האחרונים, מערכת המיוגרפיה הקאמרית הקטנה שימשה למדידת התגובה של שכבות שונות של דפנות כלי הדם בתגובה לחומרים פרמקולוגיים שונים ומוליכים עצביים בסביבה ex vivo, בזמן אמת. תגובתיות כלי דם היא מרכיב מרכזי בכלי דם מתפקדים בריאים והיא קריטית לוויסות זרימת הדם וזליפה בכלי הדם ההיקפיים והמוחיים1. בתוך דופן כלי הדם, האינטראקציה בין שכבות האנדותל והשריר החלק היא גורם מכריע בטונוס כלי הדם, אשר מושפע כל הזמן גם משינויים מבניים בשכבת רקמת החיבור המקיפה את דופן כלי הדם (אדוונטיטיה).
שכבת האנדותל שולטת בתנועת כלי הדם על ידי שחרור מספר גורמים מרחיבי כלי דם, כולל תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין (PGI2) וגורם היפר-קוטבי שמקורו באנדותל (EDHF), או על ידי ייצור חומרים וזוקונסטרוקטיביים כגון אנדותלין-1 (ET-1) ותרומבוקסאן (TXA2)2,3,4. בין הגורמים הללו, NO נחקר בהרחבה, ותפקידיו הרגולטוריים החשובים בתפקודים תאיים קריטיים אחרים כגון דלקת, נדידה, הישרדות והתפשטות צוטטו רבות בספרות המדעית 2,5.
בתחום הביולוגיה של כלי הדם, מיוגרפיה קאמרית סיפקה לפיזיולוגים של כלי הדם ולפרמקולוגים כלי יקר ואמין למדידת תפקוד האנדותל במערכת סמי-פיזיולוגית מבוקרת היטב1. כיום, ישנן שתי מערכות מיוגרף שונות העומדות לרשות המדענים: מיוגרפיה טנסומטרית (או פין) טנסומטרית (איזומטרית) ומיוגרפיה בלחץ. במערכת מיוגרפיה של חוטים, כלי הדם נמתח בין שני חוטים או פינים, מה שמאפשר מדידה איזומטרית של כוח או התפתחות מתח בדופן כלי הדם, בעוד שמיוגרפיה של לחץ היא פלטפורמה עדיפה למדידות של תגובתיות כלי הדם בעורקי התנגדות קטנים, שבהם שינויים בלחץ הדם נחשבים לגירוי העיקרי לשינויים בטונוס כלי הדם ובתנועת כלי הדם. קיימת הסכמה כללית כי עבור עורקי התנגדות קטנים כגון עורקים מזנטריים ומוחיים, מיוגרפיה בלחץ יוצרת מצב הקרוב יותר לתנאים הפיזיולוגיים בגוף האדם. ניתן להשתמש במיוגרף התא הקטן לכלי דם בקטרים קטנים מאוד (200-500 מיקרומטר) לכלי שיט גדולים בהרבה כמו אבי העורקים.
בעוד שמיוגרף התיל הוא מערכת רבת עוצמה לרישום מתח כלי הדם בתנאים איזומטריים, מיוגרף הלחץ הוא מערכת מתאימה יותר למדידת שינויים בקוטר כלי הדם בתגובה לשינויים בתנאים איזובריים. שינויי הקוטר בכלי הדם בתגובה לשינויים בלחץ או בזרימה גדולים בהרבה בעורק שרירי קטן (עורקי) בהשוואה לעורקים אלסטיים גדולים כמו אבי העורקים. מסיבות אלה, מיוגרף הלחץ נחשב כלי טוב יותר עבור כלי דם קטנים עם vasoreactivity משמעותית1. אחת החוזקות המעשיות האחרות של מיוגרפיה טנסומטרית של תא נפח קטן רב-תאי היא שניתן להבחין בתרומתם של מנגנונים שונים לתגובתיות כלי הדם על ידי לימוד מקטעים מרובים (עד ארבעה) של אותו עורק ומאותו בעל חיים כדי להפחית את השונות ולייצר נתונים חזקים וחד-משמעיים. הוא גם קל יחסית להתקנה ולתחזוקה טכנית. כלי כמעט בכל גודל ניתן ללמוד עם מיוגרף חוט. זהו פתרון חסכוני יותר להערכת תפקוד כלי הדם והוא חלופה טובה למיוגרפיה בלחץ בניסויים שבהם אורך כלי הדם המנותח קצר מדי לפרוטוקול מיוגרף הלחץ.
דו”ח זה מספק פרוטוקול מפורט להערכת תפקוד האנדותל בטבעת אבי העורקים החזה המבודדת של העכבר באמצעות פיני הרכבה בטכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית של תא נפח קטן באמצעות מערכת המיוגרפיה הרב-תאית DMT-620 (DMT-USA). פרוטוקול זה משתמש בעכבר C57BL6 זכר בן 6 חודשים עם משקל ממוצע בין 25-35 גרם. למרבה המזל, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגים שונים של בעלי חיים ומשקולות, בהתחשב במגוון הרחב של סוגי כלי שיט וקטרים כי פרוטוקול זה יכול לשמש.
Protocol
Representative Results
Discussion
תחום הביולוגיה של כלי הדם מסתמך במידה רבה על כלים המסייעים לחוקרים להעריך את השלמות התפקודית והמבנית של דופן כלי הדם. היא גם דורשת תשומת לב מיוחדת לאינטראקציות הישירות והעקיפות בין שלוש שכבות כלי הדם: האינטימה, המדיה והאדוונטיטיה. בין שלוש השכבות הללו, האינטימה נוצרת על ידי מונולאייר של ת?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (R15HL145646) ומהמכללה ללימודים מתקדמים של אוניברסיטת מידווסטרן.
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
Referencias
- Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Lerman, A., Zeiher, A. M. Endothelial function: Cardiac events. Circulation. 111 (3), 363-368 (2005).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Galley, H. F., Webster, N. R. Physiology of the endothelium. British Journal of Anaesthesia. 93 (1), 105-113 (2004).
- Orita, H., et al. In vitro evaluation of phosphate, bicarbonate, and Hepes buffered storage solutions on hypothermic injury to immature myocytes. Cardiovascular Drugs and Therapy. 8 (6), 851-859 (1994).
- Liu, Y. H., Bian, J. S. Bicarbonate-dependent effect of hydrogen sulfide on vascular contractility in rat aortic rings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (4), 866-872 (2010).
- Griffiths, K., Madhani, M. The use of wire myography to investigate vascular tone and function. Methods in Molecular Biology: Atherosclerosis. 2419, 361-367 (2022).
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): Requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. British Journal of Pharmacology. 118 (6), 1433-1440 (1996).
- Bacon, P. A. Endothelial cell dysfunction in systemic vasculitis: New developments and therapeutic prospects. Current Opinion in Rheumatology. 17 (1), 49-55 (2005).
- Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: Current concepts and clinical implications. Frontiers in Medicine. 8, 798958 (2021).
- Mikolajczyk, K., et al. The important role of endothelium and extracellular vesicles in the cellular mechanism of aortic aneurysm formation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13157 (2021).
- Vallance, P., Hingorani, A. Endothelial nitric oxide in humans in health and disease. International Journal of Experimental Pathology. 80 (6), 291-303 (1999).
- Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris, C., Papageorgiou, N., Stefanadis, C. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular Pharmacology. 10 (1), 4-18 (2012).
- Gibson, C., et al. Mild aerobic exercise blocks elastin fiber fragmentation and aortic dilatation in a mouse model of Marfan syndrome associated aortic aneurysm. Journal of Applied Physiology. 123 (1), 147-160 (2017).
- Xiao, X., Ping, N. N., Li, S., Cao, L., Cao, Y. X. An optimal initial tension for rat basilar artery in wire myography. Microvascular Research. 97, 156-158 (2015).
- Chung, A. W., Yang, H. H., Yeung, K. A., van Breemen, C. Mechanical and pharmacological approaches to investigate the pathogenesis of Marfan syndrome in the abdominal aorta. Journal of Vascular Research. 45 (4), 314-322 (2008).
- Zhong, C., et al. Age impairs soluble guanylyl cyclase function in mouse mesenteric arteries. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11412 (2021).
