Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage

Summary

Ce protocole décrit l’assemblage d’un échafaudage de nanomatrice de base Janus (JBNm) couche par couche en ajoutant des nanotubes de base Janus (JBNts), de la matriline-3 et du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) séquentiellement. Le JBNm a été fabriqué et caractérisé; De plus, il a montré une excellente bioactivité, encourageant les fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la prolifération et la différenciation.

Abstract

Divers échafaudages de biomatériaux ont été développés pour guider l’adhésion cellulaire et la prolifération dans l’espoir de promouvoir des fonctions spécifiques pour des utilisations in vitro et in vivo . L’ajout de facteurs de croissance dans ces échafaudages de biomatériaux est généralement effectué pour fournir un environnement de culture cellulaire optimal, médiant la différenciation cellulaire et ses fonctions ultérieures. Cependant, les facteurs de croissance d’un échafaudage de biomatériau conventionnel sont généralement conçus pour être libérés lors de l’implantation, ce qui pourrait entraîner des effets secondaires involontaires sur les tissus ou les cellules environnantes. Ici, la nano-matrice de base Janus (JBNm) inspirée de l’ADN a réussi à obtenir un microenvironnement hautement localisé avec une structure couche par couche pour des constructions de tissus cartilagineux autosuffisantes. Les JBNms sont auto-assemblés à partir de nanotubes de base Janus (JBNts), de matriline-3 et de facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) via la bioaffinité. Le JBNm a été assemblé à un rapport TGF-β1:matriline-3:JBNt de 1:4:10, car c’est le rapport déterminé auquel l’assemblage approprié dans la structure couche par couche pourrait se produire. Tout d’abord, la solution TGF-β1 a été ajoutée à la solution matriline-3. Ensuite, ce mélange a été pipeté plusieurs fois pour assurer une homogénéité suffisante avant l’ajout de la solution JBNt. Cela a formé le JBNm couche par couche, après avoir pipeté plusieurs fois à nouveau. Diverses expériences ont été réalisées pour caractériser la structure JBNm couche par couche, JBNts seuls, matriline-3 seul et TGF-β1 seul. La formation de JBNm a été étudiée avec des spectres d’absorption UV-Vis, et la structure du JBNm a été observée avec la microscopie électronique à transmission (TEM). Comme l’échafaudage innovant JBNm couche par couche est formé à l’échelle moléculaire, le colorant fluorescent marqué JBNm a pu être observé. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne du JBNm injectable, ce qui peut empêcher la libération de facteurs de croissance dans les zones environnantes, favoriser la chondrogenèse localisée et promouvoir un microenvironnement antihypertrophique.

Introduction

Les échafaudages en ingénierie tissulaire jouent un rôle essentiel dans la fourniture d’un soutien structurel pour la fixation cellulaire et le développement ultérieur^{des tissus 1}. En règle générale, les constructions tissulaires conventionnelles sans aucun échafaudage reposent sur l’environnement de culture cellulaire et ont ajouté des facteurs de croissance pour arbitrer la différenciation cellulaire. De plus, cet ajout de molécules bioactives dans les échafaudages est souvent l’approche privilégiée pour guider la différenciation et la fonction^{cellulaires 2,3}. Certains échafaudages peuvent imiter le microenvironnement biochimique des tissus natifs indépendamment, tandis que d’autres peuvent influencer directement les fonctions cellulaires via des facteurs de croissance. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des difficultés dans la sélection d’échafaudages qui pourraient affecter positivement l’adhésion, la croissance et la différenciation cellulaires, tout en fournissant un soutien structurel optimal et une stabilité sur une longue période ^4,5. Les molécules bioactives sont souvent faiblement liées à l’échafaudage, ce qui entraîne une libération rapide de ces protéines lors de l’implantation, ce qui entraîne leur libération dans des endroits indésirables. Cela aboutit à des effets secondaires sur des tissus ou des cellules qui n’ont pas été intentionnellement ciblés ^6,7.

Les échafaudages sont généralement faits de matériaux polymères. La nano-matrice de base Janus (JBNm) est une plate-forme d’échafaudage biomimétique créée avec une nouvelle méthode couche par couche pour la construction autonome de tissus cartilagineux⁸. Ces nouveaux nanotubes inspirés de l’ADN ont été nommés nanotubes de base Janus (JBNts), car ils imitent correctement la structure et la chimie de surface du collagène trouvé dans la matrice extracellulaire (ECM). Avec l’ajout de molécules bioactives, telles que la matriline-3 et le facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1), le JBNm peut créer un microenvironnement optimal qui peut ensuite stimuler la fonctionnalité cellulaire et tissulaire souhaitée⁹.

Les JBNt sont de nouveaux nanotubes dérivés de versions synthétiques de la nucléobase adénine et thymine. Les JBNts sont formés par auto-assemblage¹⁰; Six nucléobases synthétiques se lient pour former un anneau, et ces anneaux subissent des interactions d’empilement π-π pour créer un nanotube de 200 à 300 μm de longueur¹¹. Ces nanotubes sont structurellement similaires aux protéines de collagène; En imitant un aspect du microenvironnement cartilagineux natif, il a été démontré que les JBNt fournissent un site de fixation favorable pour les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)^11,12,13,14. Parce que les nanotubes subissent un auto-assemblage et ne nécessitent aucune sorte d’initiateur (comme la lumière UV), ils montrent un potentiel passionnant en tant qu’échafaudage injectable pour les zones de défauts difficiles à atteindre¹⁵.

La matriline-3 est une protéine structurelle de la matrice extracellulaire présente dans le cartilage. Cette protéine joue un rôle important dans la chondrogenèse et le bon fonctionnement du cartilage^16,17. Récemment, il a été inclus dans des échafaudages de biomatériaux, encourageant la chondrogenèse sans hypertrophie 9,18,19. En incluant cette protéine dans le JBNm, les cellules cartilagineuses sont attirées par un échafaudage qui contient des composants similaires à ceux de son microenvironnement natif. De plus, il a été démontré que la matriline-3 est nécessaire pour une signalisation correcte du TGF-β1 dans les chondrocytes²⁰. Les facteurs de croissance fonctionnent comme des molécules de signalisation, provoquant la croissance spécifique d’une certaine cellule ou tissu. Ainsi, pour obtenir une régénération optimale du cartilage, la matriline-3 et le TGF-β1 sont des composants essentiels du JBNm. L’ajout de TGF-β1 dans l’échafaudage couche par couche peut favoriser davantage la régénération du cartilage dans une construction tissulaire. Le TGF-β1 est un facteur de croissance utilisé pour favoriser le processus de guérison des défauts ostéochondrals, favorisant la prolifération et la différenciation des chondrocytes et des hMSC^21,22. Ainsi, le TGF-β1 joue un rôle clé dans la régénération du cartilage JBNm (J/T/M JBNm)²³, favorisant une bonne croissance surtout lorsqu’il est localisé dans les couches JBNm.

Comme mentionné précédemment, les facteurs de croissance sont généralement assemblés à l’extérieur des échafaudages sans méthodes spécifiques d’incorporation. Ici, avec la nano-architecture précisément conçue des biomatériaux, le JBNm a été développé pour un ciblage spécifique des cellules et des tissus prévus. Le JBNm est composé de TGF-β1 collé sur les surfaces JBNt dans la couche interne et de matriline-3 adhérée sur les surfaces JBNt dans la couche externe^24,25. L’incorporation de TGF-β1 dans la couche interne de la structure couche par couche permet un microenvironnement très localisé le long des fibres JBNm, créant une construction tissulaire homéostatique avec une libération beaucoup plus lente de la protéine¹². L’injectabilité du JBNm en fait une construction de tissu cartilagineux idéale pour diverses applications futures de biomatériaux²⁶.

Protocol

1. Synthèse des JBNts Préparer le monomère JBNt en utilisant des méthodes précédemment publiées, impliquant la synthèse d’une variété de composés12. Purifier le monomère JBNt brut après sa synthèse par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide d’une colonne en phase inverse. Utilisez le solvant A : 100 % d’eau, le solvant B : 100 % d’acétonitrile et le solvant C : solution aqueuse HCl avec pH = 1. Utilisez un débit …

Representative Results

Conformément au protocole, les JBNt ont été synthétisés avec succès et caractérisés par absorption UV-Vis et MET. Le JBNm est un échafaudage solide injectable qui subit un processus biomimétique rapide. Après l’ajout de JBNts à un mélange de solution de TGF-β1/matriline-3 dans un environnement physiologique, un échafaudage solide à mailles blanches a été formé indiquant l’assemblage réussi de JBNm, comme le montre la figure 1. Cela a été démontré dans les méthode…

Discussion

L’objectif de cette étude est de développer une plateforme d’échafaudage biomimétique, le JBNm, pour surmonter les limites des constructions tissulaires conventionnelles qui reposent sur des environnements de culture cellulaire pour arbitrer la différenciation cellulaire. Le JBNm est un échafaudage de structure couche par couche pour une construction de tissu cartilagineux autonome. La conception innovante est basée sur de nouveaux nanomatériaux inspirés de l’ADN, les JBNts. Le JBNm, composé de JBNts<sup …

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.