Ce protocole décrit l’assemblage d’un échafaudage de nanomatrice de base Janus (JBNm) couche par couche en ajoutant des nanotubes de base Janus (JBNts), de la matriline-3 et du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) séquentiellement. Le JBNm a été fabriqué et caractérisé; De plus, il a montré une excellente bioactivité, encourageant les fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la prolifération et la différenciation.
Divers échafaudages de biomatériaux ont été développés pour guider l’adhésion cellulaire et la prolifération dans l’espoir de promouvoir des fonctions spécifiques pour des utilisations in vitro et in vivo . L’ajout de facteurs de croissance dans ces échafaudages de biomatériaux est généralement effectué pour fournir un environnement de culture cellulaire optimal, médiant la différenciation cellulaire et ses fonctions ultérieures. Cependant, les facteurs de croissance d’un échafaudage de biomatériau conventionnel sont généralement conçus pour être libérés lors de l’implantation, ce qui pourrait entraîner des effets secondaires involontaires sur les tissus ou les cellules environnantes. Ici, la nano-matrice de base Janus (JBNm) inspirée de l’ADN a réussi à obtenir un microenvironnement hautement localisé avec une structure couche par couche pour des constructions de tissus cartilagineux autosuffisantes. Les JBNms sont auto-assemblés à partir de nanotubes de base Janus (JBNts), de matriline-3 et de facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) via la bioaffinité. Le JBNm a été assemblé à un rapport TGF-β1:matriline-3:JBNt de 1:4:10, car c’est le rapport déterminé auquel l’assemblage approprié dans la structure couche par couche pourrait se produire. Tout d’abord, la solution TGF-β1 a été ajoutée à la solution matriline-3. Ensuite, ce mélange a été pipeté plusieurs fois pour assurer une homogénéité suffisante avant l’ajout de la solution JBNt. Cela a formé le JBNm couche par couche, après avoir pipeté plusieurs fois à nouveau. Diverses expériences ont été réalisées pour caractériser la structure JBNm couche par couche, JBNts seuls, matriline-3 seul et TGF-β1 seul. La formation de JBNm a été étudiée avec des spectres d’absorption UV-Vis, et la structure du JBNm a été observée avec la microscopie électronique à transmission (TEM). Comme l’échafaudage innovant JBNm couche par couche est formé à l’échelle moléculaire, le colorant fluorescent marqué JBNm a pu être observé. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne du JBNm injectable, ce qui peut empêcher la libération de facteurs de croissance dans les zones environnantes, favoriser la chondrogenèse localisée et promouvoir un microenvironnement antihypertrophique.
Les échafaudages en ingénierie tissulaire jouent un rôle essentiel dans la fourniture d’un soutien structurel pour la fixation cellulaire et le développement ultérieurdes tissus 1. En règle générale, les constructions tissulaires conventionnelles sans aucun échafaudage reposent sur l’environnement de culture cellulaire et ont ajouté des facteurs de croissance pour arbitrer la différenciation cellulaire. De plus, cet ajout de molécules bioactives dans les échafaudages est souvent l’approche privilégiée pour guider la différenciation et la fonctioncellulaires 2,3. Certains échafaudages peuvent imiter le microenvironnement biochimique des tissus natifs indépendamment, tandis que d’autres peuvent influencer directement les fonctions cellulaires via des facteurs de croissance. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des difficultés dans la sélection d’échafaudages qui pourraient affecter positivement l’adhésion, la croissance et la différenciation cellulaires, tout en fournissant un soutien structurel optimal et une stabilité sur une longue période 4,5. Les molécules bioactives sont souvent faiblement liées à l’échafaudage, ce qui entraîne une libération rapide de ces protéines lors de l’implantation, ce qui entraîne leur libération dans des endroits indésirables. Cela aboutit à des effets secondaires sur des tissus ou des cellules qui n’ont pas été intentionnellement ciblés 6,7.
Les échafaudages sont généralement faits de matériaux polymères. La nano-matrice de base Janus (JBNm) est une plate-forme d’échafaudage biomimétique créée avec une nouvelle méthode couche par couche pour la construction autonome de tissus cartilagineux8. Ces nouveaux nanotubes inspirés de l’ADN ont été nommés nanotubes de base Janus (JBNts), car ils imitent correctement la structure et la chimie de surface du collagène trouvé dans la matrice extracellulaire (ECM). Avec l’ajout de molécules bioactives, telles que la matriline-3 et le facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1), le JBNm peut créer un microenvironnement optimal qui peut ensuite stimuler la fonctionnalité cellulaire et tissulaire souhaitée9.
Les JBNt sont de nouveaux nanotubes dérivés de versions synthétiques de la nucléobase adénine et thymine. Les JBNts sont formés par auto-assemblage10; Six nucléobases synthétiques se lient pour former un anneau, et ces anneaux subissent des interactions d’empilement π-π pour créer un nanotube de 200 à 300 μm de longueur11. Ces nanotubes sont structurellement similaires aux protéines de collagène; En imitant un aspect du microenvironnement cartilagineux natif, il a été démontré que les JBNt fournissent un site de fixation favorable pour les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)11,12,13,14. Parce que les nanotubes subissent un auto-assemblage et ne nécessitent aucune sorte d’initiateur (comme la lumière UV), ils montrent un potentiel passionnant en tant qu’échafaudage injectable pour les zones de défauts difficiles à atteindre15.
La matriline-3 est une protéine structurelle de la matrice extracellulaire présente dans le cartilage. Cette protéine joue un rôle important dans la chondrogenèse et le bon fonctionnement du cartilage16,17. Récemment, il a été inclus dans des échafaudages de biomatériaux, encourageant la chondrogenèse sans hypertrophie 9,18,19. En incluant cette protéine dans le JBNm, les cellules cartilagineuses sont attirées par un échafaudage qui contient des composants similaires à ceux de son microenvironnement natif. De plus, il a été démontré que la matriline-3 est nécessaire pour une signalisation correcte du TGF-β1 dans les chondrocytes20. Les facteurs de croissance fonctionnent comme des molécules de signalisation, provoquant la croissance spécifique d’une certaine cellule ou tissu. Ainsi, pour obtenir une régénération optimale du cartilage, la matriline-3 et le TGF-β1 sont des composants essentiels du JBNm. L’ajout de TGF-β1 dans l’échafaudage couche par couche peut favoriser davantage la régénération du cartilage dans une construction tissulaire. Le TGF-β1 est un facteur de croissance utilisé pour favoriser le processus de guérison des défauts ostéochondrals, favorisant la prolifération et la différenciation des chondrocytes et des hMSC21,22. Ainsi, le TGF-β1 joue un rôle clé dans la régénération du cartilage JBNm (J/T/M JBNm)23, favorisant une bonne croissance surtout lorsqu’il est localisé dans les couches JBNm.
Comme mentionné précédemment, les facteurs de croissance sont généralement assemblés à l’extérieur des échafaudages sans méthodes spécifiques d’incorporation. Ici, avec la nano-architecture précisément conçue des biomatériaux, le JBNm a été développé pour un ciblage spécifique des cellules et des tissus prévus. Le JBNm est composé de TGF-β1 collé sur les surfaces JBNt dans la couche interne et de matriline-3 adhérée sur les surfaces JBNt dans la couche externe24,25. L’incorporation de TGF-β1 dans la couche interne de la structure couche par couche permet un microenvironnement très localisé le long des fibres JBNm, créant une construction tissulaire homéostatique avec une libération beaucoup plus lente de la protéine12. L’injectabilité du JBNm en fait une construction de tissu cartilagineux idéale pour diverses applications futures de biomatériaux26.
L’objectif de cette étude est de développer une plateforme d’échafaudage biomimétique, le JBNm, pour surmonter les limites des constructions tissulaires conventionnelles qui reposent sur des environnements de culture cellulaire pour arbitrer la différenciation cellulaire. Le JBNm est un échafaudage de structure couche par couche pour une construction de tissu cartilagineux autonome. La conception innovante est basée sur de nouveaux nanomatériaux inspirés de l’ADN, les JBNts. Le JBNm, composé de JBNts<sup …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par les subventions NIH 7R01AR072027 et 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 et l’Université du Connecticut. Ce travail est également soutenu en partie par la subvention S10OD016435 des NIH.
10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |