Изготовление и характеристика наноматрики на основе Януса слой за слоем для содействия регенерации хряща

Summary

Этот протокол описывает сборку послойного наноматричного каркаса основания Janus (JBNm) путем последовательного добавления базовых нанотрубок Janus (JBNts), матрилина-3 и трансформирующего фактора роста Beta-1 (TGF-β1). JBNm был сфабрикован и охарактеризован; кроме того, он демонстрировал отличную биологическую активность, стимулируя функции клеток, такие как адгезия, пролиферация и дифференцировка.

Abstract

Были разработаны различные каркасы биоматериала для управления клеточной адгезией и пролиферацией в надежде способствовать выполнению конкретных функций для использования in vitro и in vivo . Добавление факторов роста в эти каркасы биоматериала обычно делается для обеспечения оптимальной среды клеточной культуры, опосредующей дифференцировку клеток и ее последующие функции. Тем не менее, факторы роста в обычном каркасе биоматериала обычно предназначены для высвобождения при имплантации, что может привести к непреднамеренным побочным эффектам на окружающие ткани или клетки. Здесь основанная на ДНК наноматрица Януса (JBNm) успешно достигла высоко локализованного микроокружения с послойной структурой для самоустойчивых конструкций хрящевой ткани. JBNms самособираются из базовых нанотрубок Janus (JBNts), матрилина-3 и трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-β1) посредством биоаффина. JBNm был собран в соотношении TGF-β1:матрилин-3:JBNt 1:4:10, поскольку это было определенное соотношение, при котором могла происходить правильная сборка в послойную структуру. Сначала к раствору матрилина-3 добавляли раствор TGF-β1. Затем эту смесь несколько раз пипетировали для обеспечения достаточной однородности перед добавлением раствора JBNt. Это образовало слой за слоем JBNm, после повторной пипетки несколько раз. Были проведены различные эксперименты, чтобы охарактеризовать послойную структуру JBNm, только JBNts, только матрилин-3 и только TGF-β1. Образование JBNm изучали с помощью спектров поглощения UV-Vis, а структуру JBNm наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). Поскольку инновационный каркас JBNm, находящийся послойно, формируется в молекулярном масштабе, можно наблюдать флуоресцентный краситель, меченый JBNm. TGF-β1 ограничен внутренним слоем инъекционного JBNm, который может предотвратить высвобождение факторов роста в окружающие области, способствовать локализованному хондрогенезу и способствовать антигипертрофному микроокружению.

Introduction

Каркасы в тканевой инженерии играют жизненно важную роль в обеспечении структурной поддержки прикрепления клеток и последующего развития тканей¹. Как правило, обычные тканевые конструкции без каких-либо строительных лесов полагаются на среду клеточной культуры и добавляют факторы роста для опосредования дифференцировки клеток. Кроме того, это добавление биологически активных молекул в каркасы часто является предпочтительным подходом в руководстве дифференцировкой клеток и функцией ^2,3. Некоторые каркасы могут имитировать биохимическое микроокружение нативных тканей независимо друг от друга, в то время как другие могут напрямую влиять на функции клеток через факторы роста. Тем не менее, исследователи часто сталкиваются с проблемами при выборе каркасов, которые могут положительно повлиять на адгезию, рост и дифференцировку клеток, обеспечивая при этом оптимальную структурную поддержку и стабильность в течение длительного периода ^4,5. Биологически активные молекулы часто слабо связаны с каркасом, что приводит к быстрому высвобождению этих белков при имплантации, что приводит к их высвобождению в нежелательных местах. Это приводит к побочным эффектам на ткани или клетки, которые не были преднамеренно нацелены ^6,7.

Строительные леса обычно изготавливаются из полимерных материалов. Наноматрица основания Януса (JBNm) представляет собой биомиметическую каркасную платформу, созданную с помощью нового послойного метода для самоустойчивой конструкции хрящевой ткани⁸. Эти новые нанотрубки, вдохновленные ДНК, были названы базовыми нанотрубками Януса (JBNts), поскольку они должным образом имитируют структуру и химию поверхности коллагена, обнаруженного во внеклеточном матриксе (ECM). С добавлением биологически активных молекул, таких как матрилин-3 и трансформирующий фактор роста бета-1 (TGF-β1), JBNm может создать оптимальное микросреднее окружение, которое затем может стимулировать желаемую функциональность клеток и тканей⁹.

JBNts представляют собой новые нанотрубки, полученные из синтетических версий нуклеооснового аденина и тимина. JBNts формируются путем самосборки¹⁰; шесть синтетических нуклеотидов связываются, образуя кольцо, и эти кольца подвергаются π-π укладочным взаимодействиям для создания нанотрубки длиной 200-300 мкм¹¹. Эти нанотрубки структурно похожи на коллагеновые белки; Имитируя аспект микроокружения нативного хряща, JBNts, как было показано, обеспечивает благоприятный участок прикрепления для хондроцитов и мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs)11,12,13,14. Поскольку нанотрубки подвергаются самосборке и не требуют какого-либо инициатора (например, ультрафиолетового света), они демонстрируют захватывающий потенциал в качестве инъекционного каркаса для труднодоступных областей дефектов¹⁵.

Матрилин-3 представляет собой структурный белок внеклеточного матрикса, содержащийся в хряще. Этот белок играет значительную роль в хондрогенезе и правильной функции хряща^16,17. В последнее время он был включен в каркас биоматериала, способствуя хондрогенезу без гипертрофии ^9,18,19. Включая этот белок в JBNm, хрящевые клетки притягиваются к каркасу, который содержит компоненты, аналогичные компонентам его нативной микросреды. Кроме того, было показано, что матрилин-3 необходим для правильной передачи сигналов TGF-β1 в хондроцитах²⁰. Факторы роста функционируют как сигнальные молекулы, вызывая специфический рост определенной клетки или ткани. Таким образом, для достижения оптимальной регенерации хряща матрилин-3 и TGF-β1 являются важными компонентами в JBNm. Добавление TGF-β1 в каркас слой за слоем может дополнительно способствовать регенерации хряща в тканевой конструкции. TGF-β1 является фактором роста, используемым для стимулирования процесса заживления остеохондральных дефектов, стимулируя пролиферацию и дифференцировку хондроцитов и hMSC^21,22. Таким образом, TGF-β1 играет ключевую роль в регенерации хряща JBNm (J / T / M JBNm) ²³, способствуя правильному росту, особенно когда он локализован в слоях JBNm.

Как упоминалось ранее, факторы роста обычно собираются на внешней стороне лесов без каких-либо конкретных методов включения. Здесь, с точно спроектированной наноархитектурой биоматериалов, JBNm был разработан для специфического нацеливания на предполагаемые клетки и ткани. JBNm состоит из TGF-β1, приклеенного к поверхностям JBNt во внутреннем слое, и матрилина-3, приклеенного к поверхностям JBNt во внешнем слое^24,25. Включение TGF-β1 во внутренний слой послойной структуры позволяет создать высоко локализованное микросреду вдоль волокон JBNm, создавая гомеостатическую тканевую конструкцию с гораздо более медленным высвобождением белка¹². Инъекционная способность JBNm делает его идеальной конструкцией хрящевой ткани для различных будущих применений биоматериала²⁶.

Protocol

1. Синтез JBNts Получают мономер JBNt с использованием ранее опубликованных способов, включающих синтез различных соединений12. Очищают сырой мономер JBNt после того, как он был синтезирован с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с исполь?…

Representative Results

Следуя протоколу, JBNt были успешно синтезированы и охарактеризованы поглощением UV-Vis и TEM. JBNm представляет собой инъекционный твердый каркас, который подвергается быстрому биомиметическому процессу. После того, как JBNts добавляли к смеси раствора TGF-β1/матрилин-3 в физиологической среде, о?…

Discussion

Целью этого исследования является разработка платформы биомиметических каркасов, JBNm, для преодоления ограничений обычных тканевых конструкций, которые полагаются на среду клеточной культуры для опосредования дифференцировки клеток. JBNm представляет собой каркас послойной структуры…

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.