Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Abstract

Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro – und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.

Introduction

Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung¹. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion ^2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während andere die Zellfunktionen über Wachstumsfaktoren direkt beeinflussen können. Forscher stoßen jedoch häufig auf Herausforderungen bei der Auswahl von Gerüsten, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Differenzierung positiv beeinflussen und gleichzeitig eine optimale strukturelle Unterstützung und Stabilität über einen langen Zeitraum bieten^{könnten 4,5}. Die bioaktiven Moleküle sind oft lose an das Gerüst gebunden, was zu einer schnellen Freisetzung dieser Proteine bei der Implantation führt, was zu ihrer Freisetzung an unerwünschten Stellen führt. Dies gipfelt in Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen, die nicht absichtlich gezielt angegriffen wurden ^6,7.

Gerüste bestehen typischerweise aus polymeren Materialien. Die Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ist eine biomimetische Gerüstplattform, die mit einer neuartigen Schicht-für-Schicht-Methode für selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt⁸ erstellt wurde. Diese neuartigen DNA-inspirierten Nanoröhren wurden Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts) genannt, da sie die Struktur und Oberflächenchemie von Kollagen in der extrazellulären Matrix (ECM) richtig nachahmen. Durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen wie Matilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) kann das JBNm eine optimale Mikroumgebung schaffen, die dann die gewünschte Zell- und Gewebefunktionalität stimulieren kann⁹.

JBNts sind neuartige Nanoröhrchen, die aus synthetischen Versionen der Nukleobase Adenin und Thymin gewonnen werden. Die JBNts werden durch Selbstorganisation¹⁰ gebildet; Sechs synthetische Nukleobasen verbinden sich zu einem Ring, und diese Ringe unterliegen π-π-Stapelwechselwirkungen, um eine Nanoröhre von 200-300 μm Länge¹¹ zu erzeugen. Diese Nanoröhrchen ähneln strukturell Kollagenproteinen; Durch die Nachahmung eines Aspekts der nativen Knorpelmikroumgebung wurde gezeigt, dass JBNts eine günstige Bindungsstelle für Chondrozyten und humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten11,12,13,14. Da die Nanoröhrchen einer Selbstorganisation unterzogen werden und keinerlei Initiator (wie UV-Licht) benötigen, zeigen sie ein aufregendes Potenzial als injizierbares Gerüst für schwer zugängliche Defektbereiche¹⁵.

Matrilin-3 ist ein strukturelles extrazelluläres Matrixprotein, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein spielt eine bedeutende Rolle bei der Chondrogenese und der richtigen Knorpelfunktion^16,17. Vor kurzem wurde es in Biomaterialgerüste aufgenommen, was die Chondrogenese ohne Hypertrophie fördert 9,18,19. Durch die Aufnahme dieses Proteins in das JBNm werden Knorpelzellen von einem Gerüst angezogen, das ähnliche Komponenten wie seine native Mikroumgebung enthält. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Matrilin-3 für die korrekte TGF-β1-Signalisierung innerhalb der Chondrozyten^{benötigt wird 20}. Wachstumsfaktoren fungieren als Signalmoleküle und verursachen spezifisches Wachstum einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes. Um eine optimale Knorpelregeneration zu erreichen, sind Matrilin-3 und TGF-β1 wesentliche Bestandteile innerhalb des JBNm. Die Zugabe von TGF-β1 in das schichtweise Gerüst kann die Knorpelregeneration in einem Gewebekonstrukt weiter fördern. TGF-β1 ist ein Wachstumsfaktor, der eingesetzt wird, um den Heilungsprozess von osteochondralen Defekten zu fördern und die Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten und hMSC zu fördern^21,22. Somit spielt TGF-β1 eine Schlüsselrolle bei der Knorpelregeneration JBNm (J/T/M JBNm)²³ und fördert das richtige Wachstum, insbesondere wenn es innerhalb der JBNm-Schichten lokalisiert ist.

Wie bereits erwähnt, werden Wachstumsfaktoren typischerweise auf der Außenseite von Gerüsten ohne spezifische Einbaumethoden montiert. Hier wurde mit der präzise gestalteten Nanoarchitektur der Biomaterialien das JBNm für das spezifische Targeting von beabsichtigten Zellen und Geweben entwickelt. Das JBNm besteht aus TGF-β1, das auf JBNt-Oberflächen in der inneren Schicht und Matrilin-3 auf JBNt-Oberflächen in der äußeren Schicht^24,25 haftet. Der Einbau von TGF-β1 in die innere Schicht der Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine stark lokalisierte Mikroumgebung entlang der JBNm-Fasern, wodurch ein homöostatisches Gewebekonstrukt mit einer viel langsameren Freisetzung des Proteins¹² entsteht. Die Injektionsfähigkeit des JBNm macht es zu einem idealen Knorpelgewebekonstrukt für verschiedene zukünftige Biomaterialanwendungen²⁶.

Protocol

1. Synthese von JBNts Herstellung des JBNt-Monomers unter Verwendung zuvor veröffentlichter Methoden, die die Synthese einer Vielzahl von Verbindungenbeinhalten 12. Reinigen Sie das rohe JBNt-Monomer, nachdem es mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule synthetisiert wurde. Verwenden Sie Lösungsmittel A: 100% Wasser, Lösungsmittel B: 100% Acetonitril und Lösungsmittel C: HCl-Wasserlösung mit pH = 1. Verw…

Representative Results

Nach dem Protokoll wurden JBNts erfolgreich synthetisiert und mit UV-Vis-Absorption und TEM charakterisiert. Das JBNm ist ein injizierbares festes Gerüst, das einen schnellen biomimetischen Prozess durchläuft. Nachdem JBNts zu einer Mischung aus TGF-β1/Matrilin-3-Lösung in einer physiologischen Umgebung gegeben wurden, bildete sich ein festes Weißmaschengerüst, das auf den erfolgreichen Zusammenbau von JBNm hinweist, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Dies wurde in den Charakterisierungs…

Discussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts³⁰, TGF-β1 und Matrilin-3,…

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.