Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.
Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro – und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.
Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung1. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion 2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während andere die Zellfunktionen über Wachstumsfaktoren direkt beeinflussen können. Forscher stoßen jedoch häufig auf Herausforderungen bei der Auswahl von Gerüsten, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Differenzierung positiv beeinflussen und gleichzeitig eine optimale strukturelle Unterstützung und Stabilität über einen langen Zeitraum bietenkönnten 4,5. Die bioaktiven Moleküle sind oft lose an das Gerüst gebunden, was zu einer schnellen Freisetzung dieser Proteine bei der Implantation führt, was zu ihrer Freisetzung an unerwünschten Stellen führt. Dies gipfelt in Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen, die nicht absichtlich gezielt angegriffen wurden 6,7.
Gerüste bestehen typischerweise aus polymeren Materialien. Die Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ist eine biomimetische Gerüstplattform, die mit einer neuartigen Schicht-für-Schicht-Methode für selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt8 erstellt wurde. Diese neuartigen DNA-inspirierten Nanoröhren wurden Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts) genannt, da sie die Struktur und Oberflächenchemie von Kollagen in der extrazellulären Matrix (ECM) richtig nachahmen. Durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen wie Matilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) kann das JBNm eine optimale Mikroumgebung schaffen, die dann die gewünschte Zell- und Gewebefunktionalität stimulieren kann9.
JBNts sind neuartige Nanoröhrchen, die aus synthetischen Versionen der Nukleobase Adenin und Thymin gewonnen werden. Die JBNts werden durch Selbstorganisation10 gebildet; Sechs synthetische Nukleobasen verbinden sich zu einem Ring, und diese Ringe unterliegen π-π-Stapelwechselwirkungen, um eine Nanoröhre von 200-300 μm Länge11 zu erzeugen. Diese Nanoröhrchen ähneln strukturell Kollagenproteinen; Durch die Nachahmung eines Aspekts der nativen Knorpelmikroumgebung wurde gezeigt, dass JBNts eine günstige Bindungsstelle für Chondrozyten und humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten11,12,13,14. Da die Nanoröhrchen einer Selbstorganisation unterzogen werden und keinerlei Initiator (wie UV-Licht) benötigen, zeigen sie ein aufregendes Potenzial als injizierbares Gerüst für schwer zugängliche Defektbereiche15.
Matrilin-3 ist ein strukturelles extrazelluläres Matrixprotein, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein spielt eine bedeutende Rolle bei der Chondrogenese und der richtigen Knorpelfunktion16,17. Vor kurzem wurde es in Biomaterialgerüste aufgenommen, was die Chondrogenese ohne Hypertrophie fördert 9,18,19. Durch die Aufnahme dieses Proteins in das JBNm werden Knorpelzellen von einem Gerüst angezogen, das ähnliche Komponenten wie seine native Mikroumgebung enthält. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Matrilin-3 für die korrekte TGF-β1-Signalisierung innerhalb der Chondrozytenbenötigt wird 20. Wachstumsfaktoren fungieren als Signalmoleküle und verursachen spezifisches Wachstum einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes. Um eine optimale Knorpelregeneration zu erreichen, sind Matrilin-3 und TGF-β1 wesentliche Bestandteile innerhalb des JBNm. Die Zugabe von TGF-β1 in das schichtweise Gerüst kann die Knorpelregeneration in einem Gewebekonstrukt weiter fördern. TGF-β1 ist ein Wachstumsfaktor, der eingesetzt wird, um den Heilungsprozess von osteochondralen Defekten zu fördern und die Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten und hMSC zu fördern21,22. Somit spielt TGF-β1 eine Schlüsselrolle bei der Knorpelregeneration JBNm (J/T/M JBNm)23 und fördert das richtige Wachstum, insbesondere wenn es innerhalb der JBNm-Schichten lokalisiert ist.
Wie bereits erwähnt, werden Wachstumsfaktoren typischerweise auf der Außenseite von Gerüsten ohne spezifische Einbaumethoden montiert. Hier wurde mit der präzise gestalteten Nanoarchitektur der Biomaterialien das JBNm für das spezifische Targeting von beabsichtigten Zellen und Geweben entwickelt. Das JBNm besteht aus TGF-β1, das auf JBNt-Oberflächen in der inneren Schicht und Matrilin-3 auf JBNt-Oberflächen in der äußeren Schicht24,25 haftet. Der Einbau von TGF-β1 in die innere Schicht der Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine stark lokalisierte Mikroumgebung entlang der JBNm-Fasern, wodurch ein homöostatisches Gewebekonstrukt mit einer viel langsameren Freisetzung des Proteins12 entsteht. Die Injektionsfähigkeit des JBNm macht es zu einem idealen Knorpelgewebekonstrukt für verschiedene zukünftige Biomaterialanwendungen26.
Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts30, TGF-β1 und Matrilin-3,…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse 7R01AR072027 und 7R03AR069383, den NSF Career Award 1905785, die NSF 2025362 und die University of Connecticut unterstützt. Diese Arbeit wird teilweise auch durch den NIH-Zuschuss S10OD016435 unterstützt.
10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |