Een nieuw ex vivo schapenhuidwondmodel met hoge doorvoer voor het testen van opkomende antibiotica
Summary
Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om een ex vivo schapen gewonde huidmodel op te zetten dat geïnfecteerd is met Staphylococcus aureus. Dit high-throughput model simuleert infecties beter in vivo in vergelijking met conventionele microbiologische technieken en biedt onderzoekers een fysiologisch relevant platform om de werkzaamheid van opkomende antimicrobiële stoffen te testen.
Abstract
De ontwikkeling van antimicrobiële stoffen is een duur proces met steeds lagere slagingspercentages, wat verdere investeringen in antimicrobieel ontdekkingsonderzoek minder aantrekkelijk maakt. Antimicrobiële geneesmiddelenontdekking en daaropvolgende commercialisering kunnen lucratiever worden gemaakt als een fail-fast-and-fail-cheap-benadering kan worden geïmplementeerd binnen de leidende optimalisatiefasen waar onderzoekers meer controle hebben over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen. In dit artikel wordt de opstelling beschreven van een ex vivo schapenwond huidmodel geïnfecteerd met Staphylococcus aureus, dat eenvoudig, kosteneffectief, hoge doorvoer en reproduceerbaar is. De bacteriële fysiologie in het model bootst na dat tijdens infectie als bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de ziekteverwekker om het weefsel te beschadigen. De vaststelling van wondinfectie wordt geverifieerd door een toename van het aantal levensvatbare bacteriën in vergelijking met het entmateriaal. Dit model kan worden gebruikt als een platform om de werkzaamheid van opkomende antimicrobiële stoffen in de leadoptimalisatiefase te testen. Er kan worden gesteld dat de beschikbaarheid van dit model onderzoekers die antimicrobiële stoffen ontwikkelen een fail-fast-and-fail-cheap model zal bieden, wat zal helpen de slagingspercentages in volgende dierproeven te verhogen. Het model zal ook de vermindering en verfijning van het gebruik van dieren voor onderzoek vergemakkelijken en uiteindelijk een snellere en kosteneffectievere vertaling van nieuwe antimicrobiële stoffen voor huid- en wekedeleninfecties naar de kliniek mogelijk maken.
Introduction
Huidinfecties zijn een belangrijk wereldwijd probleem, met grote economische kosten voor zorgverleners over de hele wereld. De ontwikkeling van multidrugresistentie en biofilmvorming door pathogenen speelt een sleutelrol in de prevalentie van niet-genezende wonden 1,2,3,4. Als gevolg hiervan zijn huid- en wekedeleninfecties een van de meest voorkomende redenen voor langdurige ziekenhuisopname en daaropvolgende heropname5. Vertragingen in wondgenezing zijn kostbaar voor zowel de patiënt als zorgverleners, met sommige schattingen die suggereren dat jaarlijks ongeveer 6,5 miljoen patiënten in de VS worden getroffen. In het Verenigd Koninkrijk resulteren huidinfecties en bijbehorende complicaties in ongeveer 75.000 sterfgevallen per jaar 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) is een formidabele wondpathogeen die vaak wordt geïsoleerd uit patiëntenwonden 2,7. De snelheid van opkomst van multidrugresistentie nam drastisch toe in de jaren 2000. Gedurende deze tijd was ongeveer 60% van de acute bacteriële huid- en huidstructuurinfecties cultuurpositief voor methicilline-resistente S. aureus1. Het toenemende aantal multiresistente stammen onder stafylokokken, en inderdaad andere pathogenen, in de afgelopen 2 decennia duidt op een dringende behoefte aan de snelle ontwikkeling van antibiotica met nieuwe werkingsmechanismen die resistentie kunnen overwinnen.
Sinds de vroege jaren 2000 worden antibiotica-ontdekkingsprogramma’s echter gedomineerd door langere ontwikkelingstijden en lage slagingspercentages, waarbij slechts 17% van de nieuwe antibiotica die klinische proeven in de VS binnenkomen, marktgoedkeuring hebben verkregen8. Dit suggereert een verschil tussen de resultaten van in vitro testen van opkomende antibiotica en hun klinische uitkomsten. Er kan worden gesteld dat deze ongelijkheid grotendeels te wijten is aan verschillen in bacteriële fysiologie tijdens infecties in vivo en tijdens conventionele microbiologische methoden bij het testen van de werkzaamheid van antibiotica in de in vitro preklinische stadia. Daarom zijn nieuwe laboratoriummethoden nodig die meer representatief zijn voor bacteriële fysiologie tijdens infectie om de slagingspercentages in antibiotica-ontdekkingsprogramma’s te verbeteren.
Huidige methoden voor het bestuderen van huidinfecties omvatten studies bij levende dieren (bijv. Muizen), ex vivo huidmodellen (bijv. Varkens) en 3D-weefselmanipulatie huidmodellen (bijv. Menselijk)9,10,11,12. Studies bij levende dieren zijn strikt gereguleerd en hebben een relatief lage doorvoer. In diermodellen veroorzaken verwonding en infectie aanzienlijk leed voor de dieren en roepen ze ethische zorgen op. Menselijke huidmodellen, ex vivo of tissue-engineered, vereisen ethische goedkeuring, naleving van lokale en wereldwijde wetgeving (de Human Tissue Act, de Verklaring van Helsinki), en er is moeite met het verkrijgen van weefsels, waarbij sommige verzoeken jaren duren om aan13,14 te voldoen. Beide modeltypen zijn arbeidsintensief en vereisen aanzienlijke expertise om experimenteel succes te garanderen. Sommige huidige ex vivo huidinfectiemodellen vereisen vooraf geënte schijven en additieven voor het wondbed om infectie mogelijk te maken; hoewel deze modellen ongelooflijk nuttig zijn, zijn er beperkingen in het infectieproces omdat additieven het gebruik van het wondbed als voedingsbron beperken 10,15,16,17. Het model dat in deze studie wordt beschreven, gebruikt geen additieven voor het wondbed, wat ervoor zorgt dat de pathologie van infectie en levensvatbare celtellingen het resultaat zijn van direct gebruik van het wondbed als de enige voedingsbron.
Gezien de behoefte aan nieuwe laboratoriummethoden, is een nieuw high-throughput ex vivo schapenmodel van huidinfecties ontwikkeld voor gebruik bij het evalueren van de werkzaamheid van opkomende antibiotica. Huidinfectiestudies worden geconfronteerd met vele uitdagingen – hoge kosten, ethische zorgen en modellen die geen volledig beeld laten zien 20,21. Ex vivo modellen en 3D explant modellen zorgen voor een betere visualisatie van het ziekteproces en de impact die behandelingen kunnen hebben vanuit een meer klinisch relevant model. Hier wordt de opzet van een nieuw schapenhuidmodel beschreven, dat eenvoudig, reproduceerbaar en klinisch relevant is en een hoge doorvoer heeft. Schapenhuid werd gekozen omdat schapen een van de grote zoogdieren zijn die vaak worden gebruikt om reacties op infecties in vivo te modelleren. Bovendien zijn ze gemakkelijk verkrijgbaar bij slachthuizen, wat zorgt voor een constante aanvoer van huid voor onderzoek, en hun karkassen zijn niet verbrand, wat een goede weefselkwaliteit garandeert. Deze studie gebruikte S. aureus als de voorbeeldpathogeen; het model werkt echter goed met andere micro-organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van antimicrobiële stoffen is een belangrijke maar dure onderneming die naar schatting ongeveer $ 1 miljard kost en ongeveer 15 jaar in beslag neemt. Meer dan 90% van de ontdekking van antimicrobiële geneesmiddelen en preklinische studies naar de werkzaamheid van antimicrobiële geneesmiddelen worden uitgevoerd door academische onderzoekers en kleine tot middelgrote bedrijven met doorgaans minder dan 50 werknemers22. Deze teams zijn zeer financieel beperkt, wat het falen van lood…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen EPSRC (EP/R513313/1) bedanken voor de financiering. De auteurs willen ook R.B Elliot en Son Abattoir in Calow, Chesterfield, bedanken voor het verstrekken van lammerenkoppen en voor het feit dat ze zo meegaand zijn in de vroege stadia van het project, Kasia Emery voor haar steun tijdens de ontwikkeling van dit protocol, en Fiona Wright van de afdeling Infectie, Immuniteit en Hart- en Vaatziekten aan de Universiteit van Sheffield voor het verwerken van de histologiemonsters en zo ongelooflijk behulpzaam zijn tijdens dit project.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
Referencias
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
