Um novo modelo de ferida cutânea de ovino ex vivo de alto rendimento para testar antibióticos emergentes

Summary

O protocolo descreve um método passo-a-passo para configurar um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectada com Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimento simula melhor infecções in vivo em comparação com técnicas convencionais de microbiologia e apresenta aos pesquisadores uma plataforma fisiologicamente relevante para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes.

Abstract

O desenvolvimento de antimicrobianos é um processo caro com taxas de sucesso cada vez mais baixas, o que torna menos atraente o investimento adicional em pesquisa de descoberta de antimicrobianos. A descoberta de medicamentos antimicrobianos e a subsequente comercialização podem se tornar mais lucrativas se uma abordagem de falhar rápido e falhar barato puder ser implementada dentro dos estágios de otimização de leads, onde os pesquisadores têm maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Neste artigo, descreve-se a configuração de um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectado com Staphylococcus aureus, que é simples, econômico, de alto rendimento e reprodutível. A fisiologia bacteriana no modelo imita que durante a infecção como proliferação bacteriana é dependente da capacidade do patógeno de danificar o tecido. O estabelecimento da infecção da ferida é verificado por um aumento na contagem bacteriana viável em comparação com o inóculo. Este modelo pode ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes no estágio de otimização de chumbo. Pode-se argumentar que a disponibilidade desse modelo fornecerá aos pesquisadores que desenvolvem antimicrobianos um modelo de falha rápida e falha barata, o que ajudará a aumentar as taxas de sucesso em testes subsequentes com animais. O modelo também facilitará a redução e o refinamento do uso de animais para pesquisa e, em última análise, permitirá uma tradução mais rápida e econômica de novos antimicrobianos para infecções de pele e tecidos moles para a clínica.

Introduction

As infecções de pele são uma questão global importante, com grandes custos econômicos para os profissionais de saúde em todo o mundo. O desenvolvimento de multirresistência e formação de biofilme por patógenos desempenha um papel fundamental na prevalência de feridas não cicatrizantes 1,2,3,4. Como resultado disso, as infecções de pele e tecidos moles são um dos motivos mais comuns para a hospitalização prolongada e posterior readmissão⁵. Atrasos na cicatrização de feridas são caros tanto para o paciente quanto para os profissionais de saúde, com algumas estimativas sugerindo que cerca de 6,5 milhões de pacientes são afetados anualmente nos EUA. No Reino Unido, infecções de pele e complicações associadas resultam em aproximadamente 75.000 mortes anuais ^2,4,6.

Staphylococcus aureus (S. aureus) é um formidável patógeno de feridas frequentemente isolado de feridas de pacientes ^2,7. A taxa de emergência de multirresistência aumentou drasticamente na década de 2000. Durante esse período, cerca de 60% das infecções bacterianas agudas da pele e da estrutura da pele foram positivas para S. aureus^resistente à meticilina 1. O crescente número de cepas multirresistentes entre os estafilococos, e de fato outros patógenos, nas últimas 2 décadas indica uma necessidade urgente de rápido desenvolvimento de antibióticos com novos modos de ação que possam superar a resistência.

No entanto, desde o início dos anos 2000, os programas de descoberta de antibióticos têm sido dominados por tempos de desenvolvimento mais longos e baixas taxas de sucesso, com apenas 17% dos novos antibióticos que entram em ensaios clínicos nos EUA alcançando aprovação no mercado⁸. Isso sugere uma disparidade entre os resultados dos testes in vitro de antibióticos emergentes e seus resultados clínicos. Pode-se argumentar que essa disparidade se deve em grande parte a diferenças na fisiologia bacteriana durante infecções in vivo e durante métodos microbiológicos convencionais ao testar a eficácia de antibióticos nos estágios pré-clínicos in vitro . Portanto, novos métodos laboratoriais que são mais representativos da fisiologia bacteriana durante a infecção são necessários para melhorar as taxas de sucesso em programas de descoberta de antibióticos.

Os métodos atuais para o estudo de infecções de pele incluem estudos em animais vivos (por exemplo, camundongos), modelos de pele ex vivo (por exemplo, suínos) e modelos de pele 3D projetados por tecidos (por exemplo, humanos)9,10,11,12. Estudos em animais vivos são estritamente regulamentados e têm rendimento relativamente baixo. Em modelos animais, ferimentos e infecções causam sofrimento significativo aos animais e levantam preocupações éticas. Os modelos de pele humana, ex vivo ou de engenharia de tecidos, requerem aprovação ética, conformidade com a legislação local e global (Lei de Tecidos Humanos, Declaração de Helsinque) e há dificuldade em adquirir tecidos, com algumas solicitações levando anos para serem atendidas^13,14. Ambos os tipos de modelos são trabalhosos e exigem conhecimentos significativos para garantir o sucesso experimental. Alguns modelos atuais de infecção cutânea ex vivo requerem discos pré-inoculados e aditivos para o leito da ferida para permitir a infecção; embora esses modelos sejam incrivelmente úteis, há limitações no processo de infecção, pois os aditivos limitam a utilização do leito da ferida como fonte de nutrientes^10,15,16,17. O modelo descrito neste estudo não utiliza aditivos para o leito da ferida, o que garante que a patologia da infecção e a contagem de células viáveis sejam resultado da utilização direta do leito da ferida como única fonte de nutrientes.

Dada a necessidade de novos métodos laboratoriais, foi desenvolvido um novo modelo ovino ex vivo de alto rendimento de infecções de pele para uso na avaliação da eficácia de antibióticos emergentes. Os estudos de infecção cutânea enfrentam muitos desafios – altos custos, preocupações éticas e modelos que não mostram um quadro completo^20,21. Modelos ex vivo e modelos explante 3D permitem uma melhor visualização do processo da doença e do impacto que os tratamentos podem ter a partir de um modelo clinicamente mais relevante. Aqui, a configuração de um novo modelo de pele ovina é descrita, que é simples, reprodutível e clinicamente relevante e tem alto rendimento. A pele ovina foi escolhida porque as ovelhas são um dos grandes mamíferos comumente usados para modelar respostas a infecções in vivo. Além disso, eles estão prontamente disponíveis nos matadouros, garantindo um suprimento constante de pele para pesquisa, e suas carcaças não são escaldadas, garantindo uma boa qualidade do tecido. Este estudo utilizou S. aureus como patógeno exemplar; no entanto, o modelo funciona bem com outros microrganismos.

Protocol

Cabeças de cordeiro do matadouro R.B Elliott e Son foram utilizadas como fonte de amostras de pele neste projeto. Todos os cordeiros foram abatidos para consumo como alimento. Em vez de descartar as cabeças, estas foram reaproveitadas para pesquisa. A aprovação ética não foi necessária, pois o tecido era proveniente de resíduos descartados de matadouros. 1. Esterilização Desinfetar a pinça antes da recolha das cabeças, tomando pinças limpas e realizando …

Representative Results

A identificação de uma via para esterilizar a pele antes da configuração do modelo de infecção da ferida foi um desafio. O desafio estava em esterilizar a pele sem danificar as diferentes camadas da pele, que podem então ter consequências não intencionais no resultado da infecção. Para identificar um regime de esterilização adequado, diferentes tratamentos foram tentados por diferentes períodos de tempo, conforme descrito na Tabela 1. A contaminação foi registrada como o desenvolvimento d…

Discussion

O desenvolvimento de antimicrobianos é um empreendimento importante, mas caro, que é estimado em cerca de US $ 1 bilhão e leva cerca de 15 anos para ser concluído. Mais de 90% da descoberta de medicamentos antimicrobianos e estudos pré-clínicos de eficácia de medicamentos antimicrobianos são realizados por pesquisadores acadêmicos e pequenas e médias empresas com tipicamente menos de 50 funcionários²². Essas equipes são muito limitadas financeiramente, o que torna calamitosa a falha da…

Materials

24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX