新しい抗生物質をテストするための新しいハイスループット Ex Vivo ヒツジ皮膚創傷モデル
Summary
プロトコルは、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルをセットアップするための段階的な方法を説明しています。このハイスループットモデルは、従来の微生物学技術と比較してin vivoでの感染をよりよくシミュレートし、新しい抗菌薬の有効性をテストするための生理学的に関連するプラットフォームを研究者に提供します。
Abstract
抗菌薬の開発は費用のかかるプロセスであり、成功率はますます低くなっているため、抗菌薬発見研究へのさらなる投資はそれほど魅力的ではありません。抗菌薬の発見とその後の商品化は、研究者が医薬品の設計と処方をより細かく制御できるリード最適化段階でフェイルファストアンドフェイルチープアプローチを実装できれば、より収益性の高いものにすることができます。この記事では、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルのセットアップについて説明しますが、これはシンプルで費用効果が高く、スループットが高く、再現性があります。モデルの細菌生理機能は、感染中の細菌増殖が病原体の組織を損傷する能力に依存することを模倣しています。創傷感染の確立は、接種材料と比較して生存細菌数の増加によって検証される。このモデルは、リード最適化段階で新しい抗菌薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用できます。このモデルの利用可能性は、抗菌薬を開発する研究者にフェイルファストアンドフェイルチープモデルを提供し、その後の動物試験の成功率を高めるのに役立つと主張することができます。このモデルはまた、研究のための動物使用の削減と改良を促進し、最終的には皮膚および軟部組織感染症に対する新規抗菌剤の臨床へのより迅速かつ費用効果の高い翻訳を可能にします。
Introduction
皮膚感染症は重要な地球規模の問題であり、世界中の医療提供者に大きな経済的コストがかかります。病原体による多剤耐性およびバイオフィルム形成の発達は、非治癒性創傷の有病率において重要な役割を果たす1,2,3,4。この結果、皮膚軟部組織の感染症は、長期入院とその後の再入院の最も一般的な理由の1つです5。創傷治癒の遅れは、患者と医療提供者の両方にとってコストがかかり、米国では年間約650万人の患者が罹患していることを示唆する推定もあります。英国では、皮膚感染症とそれに関連する合併症により、年間約75,000人が死亡しています2,4,6。
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、患者の創傷から頻繁に単離される手ごわい創傷病原体である2、7。多剤耐性の出現率は2000年代に劇的に増加しました。この間、急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の約60%がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌1の培養陽性でした。ブドウ球菌、そして実際に他の病原体の間で過去20年以内に多剤耐性株の数が増加していることは、耐性を克服することができる新しい作用機序を備えた抗生物質の迅速な開発の緊急の必要性を示しています。
しかし、2000年代初頭以降、抗菌薬探索プログラムは、より長い開発期間と低い成功率によって支配されており、米国で臨床試験に入った新規抗菌薬のわずか17%が市場承認を達成しています8。これは、新興抗生物質のin vitro試験の結果とそれらの臨床転帰との間に格差があることを示唆しています。この格差は、in vitroの前臨床段階で抗生物質の有効性をテストする際のin vivo感染中および従来の微生物学的方法中の細菌生理機能の違いに大きく起因していると主張することができます。したがって、抗生物質発見プログラムの成功率を向上させるためには、感染中の細菌生理学をより代表する新しい実験室方法が必要です。
皮膚感染症を研究するための現在の方法には、生きた動物(マウスなど)、ex vivo皮膚モデル(ブタなど)、および3D組織工学皮膚モデル(ヒトなど)での研究が含まれます9,10,11,12。生きた動物での研究は厳しく規制されており、スループットは比較的低いです。動物モデルでは、創傷と感染は動物に重大な苦痛を引き起こし、倫理的懸念を引き起こします。ex vivoまたは組織工学によるヒト皮膚モデルは、倫理的承認、国内および世界の法律(ヒト組織法、ヘルシンキ宣言)の遵守が必要であり、組織の取得が困難であり、一部の要求を満たすのに数年かかる場合があります13,14。どちらのモデルタイプも労働集約的であり、実験を成功させるにはかなりの専門知識が必要です。現在のex vivo皮膚感染モデルの中には、感染を可能にするために創傷床に事前に接種された椎間板と添加剤を必要とするものがあります。これらのモデルは非常に有用であるが、添加剤が栄養源としての創傷床の利用を制限するため、感染プロセスには制限がある10、15、16、17。この研究で説明されているモデルは、創傷床に添加物を使用していないため、感染の病理と生細胞数は、唯一の栄養源としての創傷床の直接利用の結果であることを保証します。
新しい実験室法の必要性を考慮して、新しい抗生物質の有効性を評価するために使用するための皮膚感染症の新しいハイスループットex vivoヒツジモデルが開発されました。皮膚感染症の研究は、高コスト、倫理的懸念、全体像を示さないモデルなど、多くの課題に直面しています20,21。生体外モデルと3D外植片モデルにより、疾患プロセスをより適切に視覚化でき、より臨床的に関連性のあるモデルから治療がもたらす影響が可能になります。ここでは、単純で再現性があり、臨床的に関連性があり、高いスループットを有する新しいヒツジ皮膚モデルのセットアップについて説明する。ヒツジがin vivoでの感染に対する応答をモデル化するために一般的に使用される大型哺乳類の1つとして選択されたヒツジの皮膚。さらに、それらは食肉処理場から容易に入手でき、研究用の皮膚の安定した供給を保証し、それらの死体はやけどを負わず、良好な組織品質を保証します。この研究では、黄色ブドウ球菌を模範的な病原体として使用しました。ただし、このモデルは他の微生物でもうまく機能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗菌薬の開発は重要だが費用のかかるベンチャーであり、約10億ドルの費用がかかり、完了するまでに約15年かかると推定されています。抗菌薬の発見と抗菌薬の有効性の前臨床試験の90%以上は、学術研究者や通常50人未満の中小企業によって実施されています22。これらのチームは非常に財政的に制約されており、トランスレーショナルリサーチの後期段階での鉛分子の失?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、EPSRC(EP/R513313/1)の資金提供に感謝する。著者らはまた、チェスターフィールドのカローにあるR.Bエリオットとサンアバトワールに子羊の頭を提供し、プロジェクトの初期段階で非常に親切にしてくれたこと、このプロトコルの開発を通じてサポートしてくれたカシアエメリー、シェフィールド大学の感染、免疫、心血管疾患学部のフィオナライトに組織学サンプルを処理し、このプロジェクト全体で非常に役立ったことに感謝します。
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
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