Новая высокопроизводительная модель раны овечьей кожи Ex Vivo для тестирования новых антибиотиков

Summary

Протокол описывает пошаговый метод создания модели поврежденной овец ex vivo , инфицированной золотистым стафилококком. Эта высокопроизводительная модель лучше имитирует инфекции in vivo по сравнению с обычными методами микробиологии и предоставляет исследователям физиологически значимую платформу для проверки эффективности новых противомикробных препаратов.

Abstract

Разработка противомикробных препаратов является дорогостоящим процессом со все более низкими показателями успеха, что делает дальнейшие инвестиции в исследования по обнаружению противомикробных препаратов менее привлекательными. Открытие противомикробных препаратов и последующая коммерциализация могут стать более прибыльными, если подход «быстро и безотказно дешево» может быть реализован на этапах оптимизации лидов, где исследователи имеют больший контроль над дизайном и формулированием лекарств. В этой статье описана установка модели поврежденной овец ex vivo , инфицированной золотистым стафилококком, которая является простой, экономически эффективной, высокопроизводительной и воспроизводимой. Бактериальная физиология в модели имитирует, что во время инфекции бактериальная пролиферация зависит от способности патогена повреждать ткани. Установление раневой инфекции подтверждается увеличением жизнеспособного количества бактерий по сравнению с инокулятом. Эта модель может быть использована в качестве платформы для проверки эффективности новых противомикробных препаратов на этапе оптимизации лидов. Можно утверждать, что доступность этой модели предоставит исследователям, разрабатывающим противомикробные препараты, модель «быстро и без сбоев», которая поможет повысить показатели успеха в последующих испытаниях на животных. Модель также будет способствовать сокращению и совершенствованию использования животных для исследований и в конечном итоге позволит быстрее и экономичнее переводить новые противомикробные препараты для инфекций кожи и мягких тканей в клинику.

Introduction

Кожные инфекции являются важной глобальной проблемой, с большими экономическими издержками для поставщиков медицинских услуг во всем мире. Развитие множественной лекарственной устойчивости и образование биопленки патогенами играет ключевую роль в распространенности незаживающих ран 1,2,3,4. В результате этого инфекции кожи и мягких тканей являются одной из наиболее распространенных причин длительной госпитализации и последующей реадмиссии⁵. Задержки в заживлении ран являются дорогостоящими как для пациента, так и для медицинских работников, причем, по некоторым оценкам, около 6,5 миллионов пациентов ежегодно страдают в США. В Великобритании кожные инфекции и связанные с ними осложнения приводят к примерно 75 000 смертей ежегодно ^2,4,6.

Золотистый стафилококк (S. aureus) является грозным раневым возбудителем, часто выделяемым из ран пациента ^2,7. Скорость появления множественной лекарственной устойчивости резко возросла в 2000-х годах. В течение этого времени около 60% острых бактериальных инфекций кожи и структуры кожи были положительными для метициллин-резистентного S. aureus¹. Растущее число штаммов с множественной лекарственной устойчивостью среди стафилококков, да и других патогенов, в течение последних 2 десятилетий указывает на острую необходимость быстрой разработки антибиотиков с новыми способами действия, которые могут преодолеть резистентность.

Тем не менее, с начала 2000-х годов в программах открытия антибиотиков доминировало более длительное время разработки и низкие показатели успеха, и только 17% новых антибиотиков, поступающих в клинические испытания в США, достигли одобрения рынка⁸. Это говорит о несоответствии между результатами тестирования in vitro новых антибиотиков и их клиническими результатами. Можно утверждать, что это несоответствие во многом связано с различиями в физиологии бактерий во время инфекций in vivo и во время обычных микробиологических методов при тестировании эффективности антибиотиков на доклинических стадиях in vitro . Поэтому новые лабораторные методы, которые более репрезентативны для бактериальной физиологии во время инфекции, необходимы для улучшения показателей успеха в программах открытия антибиотиков.

Современные методы изучения кожных инфекций включают исследования на живых животных (например, мышах), моделях кожи ex vivo (например, свиней) и 3D-тканеинженерных моделях кожи (например, человека)9,10,11,12. Исследования на живых животных строго регламентированы и имеют относительно низкую пропускную способность. На животных моделях раны и инфекции вызывают значительные страдания у животных и вызывают этические проблемы. Модели кожи человека, ex vivo или тканевые, требуют этического одобрения, соблюдения местного и глобального законодательства (Закон о тканях человека, Хельсинкская декларация), и существуют трудности с приобретением тканей, причем для выполнения некоторых запросов требуются годы для выполнения^13,14. Оба типа моделей являются трудоемкими и требуют значительных знаний для обеспечения успеха экспериментов. Некоторые современные модели инфекции кожи ex vivo требуют предварительно инокулированных дисков и добавок для раневого ложа, чтобы обеспечить инфекцию; хотя эти модели невероятно полезны, существуют ограничения в процессе заражения, поскольку добавки ограничивают использование раневого ложа в качестве источника питательных веществ 10,15,16,17. Модель, описанная в этом исследовании, не использует никаких добавок к раневому слою, что гарантирует, что патология инфекции и количество жизнеспособных клеток являются результатом прямого использования раневого ложа в качестве единственного источника питательных веществ.

Учитывая необходимость новых лабораторных методов, была разработана новая высокопроизводительная модель овец ex vivo для использования при оценке эффективности новых антибиотиков. Исследования кожных инфекций сталкиваются со многими проблемами – высокими затратами, этическими проблемами и моделями, которые не показывают полной картины^20,21. Модели ex vivo и 3D-модели эксплантата позволяют лучше визуализировать процесс заболевания и влияние, которое лечение может оказать от более клинически значимой модели. Здесь описана установка новой модели овечьей кожи, которая проста, воспроизводима и клинически значима и имеет высокую пропускную способность. Овечья кожа была выбрана, поскольку овцы являются одним из крупных млекопитающих, обычно используемых для моделирования реакций на инфекции in vivo. Кроме того, они легко доступны со скотобоен, обеспечивая постоянный запас кожи для исследований, а их туши не ошпариваются, обеспечивая хорошее качество тканей. В этом исследовании в качестве примера патогена использовался S. aureus; однако модель хорошо работает с другими микроорганизмами.

Protocol

Головы ягнят из скотобойни R.B Elliott и Son Abattoir были использованы в качестве источника образцов кожи в этом проекте. Всех ягнят забивали для потребления в пищу. Вместо того, чтобы отбрасывать головы, они были перепрофилированы для исследований. Этическое одобрение не требовалось, поскольку …

Representative Results

Определение пути стерилизации кожи перед созданием модели раневой инфекции было сложной задачей. Задача заключалась в стерилизации кожи без повреждения различных слоев кожи, что затем может иметь непреднамеренные последствия в результате инфекции. Чтобы определить подходящий режим …

Discussion

Разработка противомикробных препаратов является важным, но дорогостоящим предприятием, которое, по оценкам, стоит около 1 миллиарда долларов и занимает около 15 лет. Более 90% открытий противомикробных препаратов и доклинических исследований эффективности противомикробных препаратов ?…

Materials

24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX