Positronemissietomografie Beeldvorming van celhandel: een methode voor celradiolabeling

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het radioactief labelen van cellen met een positronemissietomografie (PET) radio-isotoop, 89 Zr (t_1/2 78,4 uur), met behulp van een kant-en-klaar radioactief labelend synthon, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). Radiolabeling van cellen met [⁸⁹Zr]Zr-DBN maakt niet-invasieve tracking en beeldvorming mogelijk van toegediende radioactief gelabelde cellen in het lichaam met PET tot 7 dagen na toediening.

Abstract

Stamcel- en chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapieën zijn in opkomst als veelbelovende therapieën voor orgaanregeneratie en als immunotherapie voor verschillende vormen van kanker. Ondanks dat er op deze gebieden aanzienlijke vooruitgang is geboekt, moet er nog meer worden geleerd om de farmacokinetiek en farmacodynamiek van de toegediende therapeutische cellen in het levende systeem beter te begrijpen. Voor niet-invasieve, in vivo tracking van cellen met positronemissietomografie (PET) is een nieuwe [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN)-gemedieerde celradiolabelingmethode ontwikkeld met behulp van ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 uur). Het huidige protocol beschrijft een [⁸⁹Zr]Zr-DBN-gemedieerde, kant-en-klare, radiolabelende synthon voor directe radiolabeling van verschillende cellen, waaronder mesenchymale stamcellen, afstammingsgeleide cardiopoëtische stamcellen, leverregenererende hepatocyten, witte bloedcellen, melanoomcellen en dendritische cellen. De ontwikkelde methodologie maakt niet-invasieve PET-beeldvorming van celhandel mogelijk tot 7 dagen na toediening zonder de aard of de functie van de radioactief gelabelde cellen aan te tasten. Daarnaast beschrijft dit protocol een stapsgewijze methode voor de radiosynthese van [89 Zr]Zr-DBN, biocompatibele formulering van [89 Zr]Zr-DBN, voorbereiding van cellen voor radiolabeling en ten slotte de radiolabeling van cellen met [⁸⁹Zr]Zr-DBN, inclusief alle ingewikkelde details die nodig zijn voor de succesvolle radiolabeling van cellen.

Introduction

Stamcel- en chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapieën winnen aan populariteit en worden actief onderzocht voor de behandeling van verschillende ziekten, zoals myocardiale insufficiëntie^1,2, retinale degeneratie 2, maculadegeneratie 2, diabetes ², myocardinfarct^3,4,5 en kankers ^6,7,8,9,10. Van de twee plausibele benaderingen van stamceltherapieën kunnen stamcellen ofwel rechtstreeks op de plaats van de ziekte worden geënt om een therapeutische respons te veroorzaken, ofwel veranderingen in de micro-omgeving van de ziekteplaats veroorzaken zonder zich aan de ziekteplaats te hechten om een indirecte therapeutische respons op gang te brengen. Een indirecte therapeutische respons kan veranderingen in de micro-omgeving van de plaats van de ziekte veroorzaken door factoren vrij te geven die de ziekte zouden herstellen of behandelen^. Deze benaderingen van stamceltherapieën kunnen worden geëvalueerd door niet-invasieve beeldvorming van radioactief gelabelde stamcellen. Niet-invasieve beeldvorming zou de opname van de radioactief gelabelde cellen op de plaats van de ziekte kunnen correleren met een therapeutische respons om de directe versus indirecte therapeutische respons te ontcijferen.

Daarnaast worden op immuuncellen gebaseerde therapieën ontwikkeld om verschillende vormen van kanker te behandelen met behulp van CAR T-cel 6,7,8,9,10 en dendritische celimmunotherapie ^11,12. Mechanistisch gezien worden T-cellen in CAR T-celimmunotherapie 6,7,8,9,10 gemanipuleerd om een epitoop tot expressie te brengen dat zich bindt aan een specifiek antigeen op tumoren die moeten worden behandeld. Deze gemanipuleerde CAR-T-cellen binden zich bij toediening aan het specifieke antigeen dat aanwezig is op de tumorcellen via een epitoop-antigeeninteractie. Na binding ondergaan de gebonden CAR-T-cellen activering en prolifereren ze vervolgens en geven ze cytokines af, die het immuunsysteem van de gastheer signaleren om de tumor aan te vallen die het specifieke antigeen tot expressie brengt. In het geval van dendritische celtherapieën^11,12 daarentegen worden dendritische cellen gemanipuleerd om een specifiek kankerantigeen op hun oppervlak te presenteren. Deze gemanipuleerde dendritische cellen herbergen bij toediening de lymfeklieren en binden zich aan de T-cellen in de lymfeklieren. De T-cellen ondergaan, na binding aan de specifieke kankerantigenen op de toegediende dendritische cellen, activering/proliferatie en initiëren een immuunrespons van de gastheer tegen de tumor die dat specifieke antigeen tot expressie brengt. Daarom is de beoordeling van het transport van toegediende CAR-T-cellen naar een tumorplaats 9,10 en homing van dendritische cellen naar de lymfeklieren^11,12 mogelijk door radioactief gelabelde CAR-T-cellen en dendritische cellen in beeld te brengen om de werkzaamheid van immunotherapie te bepalen. Bovendien kan niet-invasieve celhandel helpen om het therapeutisch potentieel beter te begrijpen, de directe versus indirecte therapeutische respons te verduidelijken en de therapeutische respons van zowel stamcel- als immuuncelgebaseerde therapieën te voorspellen en te monitoren.

Er zijn verschillende beeldvormingsmodaliteiten voor celhandel onderzocht 3,4,9,10,12, waaronder optische beeldvorming^, magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), computertomografie met enkelvoudige fotonemissie (SPECT) en positronemissietomografie (PET). Elk van deze technieken heeft zijn eigen voor- en nadelen. Hiervan is PET de meest veelbelovende modaliteit vanwege het kwantitatieve karakter en de hoge gevoeligheid, die essentieel zijn voor de betrouwbare kwantificering van cellen in op beeldvorming gebaseerde celhandel 3,4,9,10.

De positron-emitterende radio-isotoop ⁸⁹Zr, met een halfwaardetijd van 78,4 uur, is geschikt voor cellabeling. Het maakt PET-beeldvorming van celhandel gedurende meer dan 1 week mogelijk en wordt gemakkelijk geproduceerd door algemeen verkrijgbare, energiezuinige medische cyclotrons 13,14,15,16,17. Bovendien is een op de juiste manier gefunctionaliseerde, p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) chelator in de handel verkrijgbaar voor de synthese van een 89 Zr-gelabelde, kant-en-klare cellabelsynthon, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, ook bekend als [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. Het principe van [89 Zr]Zr-DBN-gemedieerde cellabeling is gebaseerd op een reactie tussen primaire aminen van celmembraaneiwitten en het isothiocyanaat (NCS)-deel van [⁸⁹Zr]Zr-DBN om een stabiele covalente thioureumbinding te produceren.

[⁸⁹Zr] Zr-DBN-gebaseerde cellabeling en beeldvorming zijn gepubliceerd om een verscheidenheid aan verschillende cellen te volgen, waaronder stamcellen 18,23,25, dendritische cellen¹⁸, cardiopoëtische stamcellen¹⁹, deciduale stromale cellen 20, beenmerg-afgeleide macrofagen 20, perifere bloed mononucleaire cellen 20, Jurkat/CAR T-cellen²¹, hepatocyten ^22,24 en witte bloedcellen ²⁵. Het volgende protocol biedt stapsgewijze methoden voor bereiding en radioactieve labeling van cellen met [⁸⁹Zr]Zr-DBN en beschrijft wijzigingen die nodig kunnen zijn in het radiolabelingsprotocol voor een specifiek celtype. Voor meer duidelijkheid is de hier gepresenteerde methode van celradiolabeling verdeeld in vier secties. Het eerste deel behandelt de bereiding van [89 Zr]Zr-DBN door ⁸⁹Zr te cheleren met DFO-Bn-NCS. Het tweede deel beschrijft de bereiding van een biocompatibele formulering van [⁸⁹Zr]Zr-DBN die gemakkelijk kan worden gebruikt voor radioactieve labeling van cellen. Het derde deel behandelt de stappen die nodig zijn voor de preconditionering van cellen voor radiolabeling. De preconditionering van cellen omvat het wassen van de cellen met eiwitvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en HEPES-gebufferde Hanks gebalanceerde zoutoplossing (H-HBSS) om externe eiwitten te verwijderen, die de reactie van [⁸⁹Zr]Zr-DBN met primaire aminen die aanwezig zijn op de eiwitten van het celoppervlak tijdens radiolabeling kunnen verstoren of concurreren. Het laatste deel bevat de stappen die betrokken zijn bij de daadwerkelijke radiolabeling van de cellen en de analyse van de kwaliteitscontrole.

Protocol

Dendritische cellen en melanoomcellen werden commercieel verkregen18. Hepatocyten werden geïsoleerd uit de lever van varkens na laparoscopische partiële hepatectomie22,24. Stamcellen werden geïsoleerd uit beenmergaspiraten18,19,26. De van vetweefsel afgeleide stamcellen werden verkregen van het Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Roc…

Representative Results

De representatieve resultaten die in dit manuscript worden gepresenteerd, zijn samengesteld uit de eerdere [89Zr]Zr-DBN-synthese- en celradiolabelingstudies 18,19,22,23,24,25. Kortom, 89Zr kan met succes worden gecomplexeerd met DFO-Bn-NCS in ~30-60 min bij 25-37 °C met behulp van 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS …

Discussion

Hieronder volgen kritieke stappen in het protocol die moeten worden geoptimaliseerd voor effectieve radiolabeling van cellen. In protocolstappen 1.2 en 1.3 moet, afhankelijk van het gebruikte volume van [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ of [⁸⁹Zr]ZrCl₄, een geschikt volume (microliter) base worden gebruikt; 1,0 M K 2 CO 3 oplossing moet worden gebruikt voor de neutralisatie van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 en 1,0 M Na ₂ CO₃ oplossing voor de neutralis…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG