Позитронно-эмиссионная томография клеточного транспорта: метод радиомечения клеток
Summary
Здесь представлен протокол радиоактивного мечения клеток радиоизотопом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) 89 Zr (t1/2 78,4 ч) с использованием готового к использованию синтона радиомечения, [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин ([89Zr]Zr-DBN). Радиоактивное мечение клеток с помощью [89Zr]Zr-DBN позволяет неинвазивно отслеживать и визуализировать введенные радиоактивно меченные клетки в организме с помощью ПЭТ в течение 7 дней после введения.
Abstract
Т-клеточная терапия стволовыми клетками и химерными антигенными рецепторами (CAR) становится перспективной терапией для регенерации органов и иммунотерапии различных видов рака. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в этих областях, еще многое предстоит узнать, чтобы лучше понять фармакокинетику и фармакодинамику вводимых терапевтических клеток в живой системе. Для неинвазивного отслеживания клеток in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) был разработан новый [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин ([89 Zr]Zr-DBN)-опосредованный метод радиомечения клеток с использованием 89Zr (t1/2 78,4 ч). В настоящем протоколе описан [89Zr]Zr-DBN-опосредованный, готовый к использованию, радиомечущий синтон для прямого радиоактивного мечения различных клеток, включая мезенхимальные стволовые клетки, кардиопоэтические стволовые клетки, управляемые линией, регенерирующие гепатоциты печени, лейкоциты, клетки меланомы и дендритные клетки. Разработанная методика позволяет проводить неинвазивную ПЭТ-визуализацию клеточного транспорта в течение 7 дней после введения, не влияя на природу или функцию радиоактивно меченных клеток. Кроме того, в этом протоколе описывается поэтапный метод радиосинтеза [89 Zr]Zr-DBN, биосовместимая формулировка [89 Zr]Zr-DBN, подготовка клеток к радиоактивному мечению и, наконец, радиомечение клеток с помощью [89Zr]Zr-DBN, включая все сложные детали, необходимые для успешного радиомечения клеток.
Introduction
Т-клеточная терапия стволовыми клетками и химерными антигенными рецепторами (CAR) набирает популярность и активно исследуется для лечения различных заболеваний, таких как недостаточность миокарда1,2, дегенерация сетчатки 2, дегенерация желтого пятна 2, диабет 2, инфаркт миокарда 3,4,5 и рак 6,7,8,9,10. Среди двух вероятных подходов терапии стволовыми клетками стволовые клетки могут быть либо непосредственно приживлены к очагу заболевания, чтобы вызвать терапевтический ответ, либо вызвать изменения в микроокружении очага заболевания без прилипания к очагу заболевания, чтобы инициировать непрямой терапевтический ответ. Непрямой терапевтический ответ может вызвать изменения в микроокружении очага заболевания путем высвобождения факторов, которые могут восстанавливать или лечить заболевание5. Эти подходы к лечению стволовыми клетками могут быть оценены с помощью неинвазивной визуализации радиомеченных стволовых клеток. Неинвазивная визуализация может соотнести поглощение радиоактивно меченных клеток в очаге заболевания с терапевтическим ответом, чтобы расшифровать прямой и непрямой терапевтический ответ.
Кроме того, для лечения различных видов рака разрабатывается терапия на основе иммунных клеток с использованием CAR-T-клеток 6,7,8,9,10 и иммунотерапии дендритными клетками 11,12. Механистически при CAR-Т-клеточной иммунотерапии 6,7,8,9,10 Т-клетки сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать эпитоп, который связывается со специфическим антигеном на опухолях, которые необходимо лечить. Эти сконструированные CAR-Т-клетки при введении связываются со специфическим антигеном, присутствующим в опухолевых клетках, посредством взаимодействия эпитоп-антиген. После связывания связанные CAR-Т-клетки подвергаются активации, а затем пролиферируют и высвобождают цитокины, которые сигнализируют иммунной системе хозяина атаковать опухоль, экспрессирующую специфический антиген. В отличие от этого, в случае терапии дендритными клетками11,12 дендритные клетки сконструированы таким образом, чтобы представлять на своей поверхности специфический раковый антиген. Эти сконструированные дендритные клетки при введении оседают в лимфатических узлах и связываются с Т-клетками в лимфатических узлах. Т-клетки, связываясь со специфическими раковыми антигенами на введенных дендритных клетках, подвергаются активации/пролиферации и инициируют иммунный ответ хозяина против опухоли, экспрессирующей этот специфический антиген. Таким образом, оценка транспорта введенных CAR-Т-клеток к опухолевому очагу9,10 и хоминг дендритных клеток к лимфатическим узлам11,12 возможна с помощью визуализации радиоактивно меченных CAR T-клеток и дендритных клеток для определения эффективности иммунотерапии. Кроме того, неинвазивный транспорт клеток может помочь лучше понять терапевтический потенциал, прояснить прямой и непрямой терапевтический ответ, а также прогнозировать и контролировать терапевтический ответ как на терапию стволовыми клетками, так и на основе иммунных клеток.
Были изучены различные методы визуализации для транспортировки клеток 3,4,9,10,12, включая оптическую визуализацию, магнитно-резонансную томографию (МРТ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ). Каждая из этих методик имеет свои преимущества и недостатки. Среди них ПЭТ является наиболее перспективным методом благодаря своей количественной природе и высокой чувствительности, которые необходимы для надежного количественного определения клеток при транспортировке клеток на основе визуализации 3,4,9,10.
Позитронно-излучающий радиоизотоп 89Zr с периодом полураспада 78,4 ч пригоден для мечения клеток. Он позволяет проводить ПЭТ-визуализацию клеток в течение более 1 недели и легко производится с помощью широко доступных низкоэнергетических медицинских циклотронов 13,14,15,16,17. Кроме того, коммерчески доступен соответствующим образом функционализированный хелатор-изотиоцианатобензилдесфериоксамина (DFO-Bn-NCS) для синтеза 89-Zr-меченного, готового к использованию синтона, мечущего клетки, [89 Zr]Zr-p-изотиоцианатобензил-деферриоксамин, также известного как [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24 ,25. Принцип [89 Zr]Zr-DBN-опосредованного мечения клеток основан на реакции между первичными аминами белков клеточной мембраны и изотиоцианатным (NCS) фрагментом [89Zr]Zr-DBN с образованием стабильной ковалентной тиомочевинной связи.
[89зр] Для отслеживания различных клеток, включая стволовые клетки 18,23,25, дендритные клетки18, кардиопоэтические стволовые клетки19, децидуальные стромальные клетки 20, макрофаги костного мозга 20, мононуклеарные клетки периферической крови 20, Т-клетки21, гепатоциты22,24 и лейкоциты 25. В следующем протоколе представлены пошаговые методы подготовки и радиоактивного мечения клеток с помощью [89Zr]Zr-DBN и описаны изменения, которые могут потребоваться в протоколе радиомечения для конкретного типа клеток. Для большей наглядности представленный здесь метод радиомечения клеток разделен на четыре раздела. Первый раздел посвящен получению [89 Zr]Zr-DBN путем хелатирования 89Zr с DFO-Bn-NCS. Во втором разделе описывается приготовление биосовместимой формулы [89Zr]Zr-DBN, которая может быть легко использована для мечения клеток радиотерапией. В третьем разделе описываются этапы, необходимые для предварительной подготовки клеток к радиоактивному мечению. Предварительное кондиционирование клеток включает в себя промывание клеток безбелковым фосфатно-солевым буфером (PBS) и сбалансированным солевым раствором HEPES (H-HBSS) для удаления внешних белков, которые могут мешать или конкурировать с реакцией [89Zr]Zr-DBN с первичными аминами, присутствующими на белках клеточной поверхности во время радиоактивного мечения. В заключительном разделе описаны этапы, связанные с фактическим радиоактивным мечением клеток и анализом контроля качества.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ниже приведены важнейшие этапы протокола, которые необходимо оптимизировать для эффективного клеточного радиомечения. На этапах протокола 1.2 и 1.3, в зависимости от используемого объема [89 Zr]Zr(HPO 4)2 или [89Zr]ZrCl4, необходимо использовать соответствующий объем (микрол?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 и DOE DE-SC0008947, Международным агентством по атомной энергии, Вена, Отделением ядерной медицины клиники Майо, отделением радиологии, и Центром регенеративной медицины клиники Майо, Рочестер, Миннесота. Все фигуры были созданы с использованием BioRender.com.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
| Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
| Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
| Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
| Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
| Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
| Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
Referencias
- Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
- Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
- Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
- Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
- Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
- Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
- Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
- Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
- Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
- Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
- Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
- Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
- Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
- Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
- Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
- Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
- Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
- Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
- Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
- Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
- Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
- Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
- Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
- Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
- Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
- Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
- Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
- Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
- de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).
