Hücre Kaçakçılığının Pozitron Emisyon Tomografisi Görüntülemesi: Bir Hücre Radyo-Etiketleme Yöntemi
Summary
Burada sunulan, kullanıma hazır bir radyoetiketleme synthonu, [89 Zr]Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89Zr]Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89 Zr]Zr-DBN) kullanılarak bir pozitron emisyon tomografisi (PET) radyoizotopu, 89Zr (t1/2 78.4 h) ile radyoetiket hücrelerine yönelik bir protokoldür. [89Zr] Zr-DBN ile radyo-etiketleme hücreleri, uygulamadan sonra 7 güne kadar PET ile vücutta uygulanan radyoaktif işaretli hücrelerin invaziv olmayan izlenmesine ve görüntülenmesine izin verir.
Abstract
Kök hücre ve kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi tedavileri, organ rejenerasyonu için umut verici terapötikler ve çeşitli kanserler için immünoterapi olarak ortaya çıkmaktadır. Bu alanlarda önemli ilerlemeler kaydedilmiş olmasına rağmen, canlı sistemde uygulanan terapötik hücrelerin farmakokinetiğini ve farmakodinamiğini daha iyi anlamak için öğrenilecek daha çok şey vardır. Pozitron emisyon tomografisi (PET) ile hücrelerin noninvaziv, in vivo takibi için, 89 Zr (t1/2 78.4 saat) kullanılarak yeni bir [89Zr] Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89Zr] Zr-DBN) aracılı hücre radyoetiketleme yöntemi geliştirilmiştir. Mevcut protokol, mezenkimal kök hücreler, soy kılavuzluğunda kardiyopoietik kök hücreler, karaciğer yenileyici hepatositler, beyaz kan hücreleri, melanom hücreleri ve dendritik hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücrelerin doğrudan radyoetiketlenmesi için [89Zr] Zr-DBN aracılı, kullanıma hazır, radyo-etiketleme synthonunu tanımlar. Geliştirilen metodoloji, radyoaktif işaretli hücrelerin doğasını veya işlevini etkilemeden, uygulamadan sonraki 7 güne kadar hücre trafiğinin noninvaziv PET görüntülemesini sağlar. Ek olarak, bu protokol, [89 Zr]Zr-DBN’nin radyosentezi, [89Zr]Zr-DBN’nin biyouyumlu formülasyonu, radyoetiketleme için hücrelerin hazırlanması ve son olarak hücrelerin [89Zr] Zr-DBN ile radyoetiketlenmesi için aşamalı bir yöntemi açıklar.
Introduction
Kök hücre ve kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi tedavileri popülerlik kazanmakta ve miyokard yetmezliği1,2, retina dejenerasyonu 2, makula dejenerasyonu 2, diyabet 2, miyokard enfarktüsü 3,4,5 ve kanserler 6,7,8,9 gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için aktif olarak araştırılmaktadır.10. Kök hücre tedavilerinin iki makul yaklaşımı arasında, kök hücreler ya terapötik bir yanıta neden olmak için doğrudan hastalık bölgesine aşılanabilir ya da dolaylı bir terapötik yanıt başlatmak için hastalık bölgesine bağlı kalmadan hastalık bölgesinin mikro çevresinde değişikliklere neden olabilir. Dolaylı bir terapötik yanıt, hastalığı onaracak veya tedavi edecek faktörleri serbest bırakarak hastalık bölgesinin mikro çevresinde değişikliklere neden olabilir5. Kök hücre tedavilerinin bu yaklaşımları, radyoaktif işaretli kök hücrelerin noninvaziv görüntülenmesi ile değerlendirilebilir. Noninvaziv görüntüleme, hastalık bölgesindeki radyoaktif işaretli hücrelerin alımını, doğrudan ve dolaylı terapötik yanıtı deşifre etmek için terapötik bir yanıtla ilişkilendirebilir.
Ek olarak, CAR T-hücresi 6,7,8,9,10 ve dendritik hücre immünoterapisi 11,12 kullanılarak çeşitli kanserleri tedavi etmek için bağışıklık hücresi bazlı tedaviler geliştirilmektedir. Mekanik olarak, CAR T hücresi immünoterapisi 6,7,8,9,10’da, T hücreleri, tedavi edilmesi gereken tümörler üzerindeki spesifik bir antijene bağlanan bir epitopu eksprese edecek şekilde tasarlanmıştır. Bu tasarlanmış CAR T hücreleri, uygulama üzerine, bir epitop-antijen etkileşimi yoluyla tümör hücrelerinde bulunan spesifik antijene bağlanır. Bağlandıktan sonra, bağlı CAR T hücreleri aktivasyona uğrar ve daha sonra çoğalır ve sitokinleri serbest bırakır, bu da konağın bağışıklık sistemine spesifik antijeni eksprese eden tümöre saldırması için sinyal verir. Buna karşılık, dendritik hücre tedavileri11,12 söz konusu olduğunda, dendritik hücreler, yüzeylerinde spesifik bir kanser antijeni sunacak şekilde tasarlanmıştır. Bu tasarlanmış dendritik hücreler, uygulandığında, lenf düğümlerine ev sahipliği yapar ve lenf düğümlerindeki T hücrelerine bağlanır. T hücreleri, uygulanan dendritik hücreler üzerindeki spesifik kanser antijenlerine bağlandıktan sonra, aktivasyon / proliferasyona uğrar ve bu spesifik antijeni eksprese eden tümöre karşı konakçının bir bağışıklık tepkisini başlatır. Bu nedenle, immünoterapinin etkinliğini belirlemek için radyoaktif işaretli CAR T hücrelerinin ve dendritik hücrelerin lenf nodlarına 11,12 yönlendirilmesinin değerlendirilmesi, uygulanan CAR T hücrelerinin bir tümör bölgesine9,10 ve dendritik hücrelerin 11,12 yönlendirilmesinin değerlendirilmesi mümkündür. Ayrıca, noninvaziv hücre kaçakçılığı, terapötik potansiyelin daha iyi anlaşılmasına, doğrudan ve dolaylı terapötik yanıtın netleştirilmesine ve hem kök hücre hem de bağışıklık hücresi bazlı tedavilerin terapötik yanıtının tahmin edilmesine ve izlenmesine yardımcı olabilir.
Optik görüntüleme, manyetik rezonans görüntüleme (MRI), tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve pozitron emisyon tomografisi (PET) dahil olmak üzere hücre kaçakçılığı için farklı görüntüleme yöntemleri araştırılmıştır 3,4,9,10,12. Bu tekniklerin her birinin kendine göre avantajları ve dezavantajları vardır. Bunlar arasında PET, görüntülemeye dayalı hücre trafiğinde hücrelerin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için gerekli olan kantitatif doğası ve yüksek duyarlılığı nedeniyle en umut verici yöntemdir 3,4,9,10.
Yarı ömrü 78.4saat olan pozitron yayan radyoizotop 89 Zr, hücre etiketlemesi için uygundur. 1 haftadan fazla bir süre boyunca hücre kaçakçılığının PET görüntülemesine izin verir ve yaygın olarak bulunan, düşük enerjili tıbbi siklotronlar 13,14,15,16,17 tarafından kolayca üretilir. Ek olarak, uygun şekilde işlevselleştirilmiş, p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin (DFO-Bn-NCS) şelatörü, 89 Zr etiketli, kullanıma hazır, hücre etiketleme sentezi için ticari olarak mevcuttur, [89 Zr] Zr-p-izotiyosiyanosiyatobenzil-desferrioksamin, [89Zr] Zr-Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24 olarak da bilinir,25. [89Zr] Zr-DBN aracılı hücre etiketleme ilkesi, kararlı bir kovalent tiyoüre bağı üretmek için hücre zarı proteinlerinin birincil aminleri ile [89Zr] Zr-DBN’nin izotiyosiyanat (NCS) kısmı arasındaki reaksiyona dayanır.
[89Zr] Zr-DBN tabanlı hücre etiketleme ve görüntüleme, kök hücreler 18,23,25, dendritik hücreler 18, kardiyopoietik kök hücreler19, desidual stromal hücreler 20, kemik iliği kaynaklı makrofajlar 20, periferik kan mononükleer hücreleri 20, Jurkat/CAR T hücreleri 21, hepatositler 22,24 ve beyaz kan hücreleri 25 dahil olmak üzere çeşitli farklı hücreleri izlemek için yayınlanmıştır . Aşağıdaki protokol, [89Zr]Zr-DBN ile adım adım hazırlama ve hücre radyo-etiketleme yöntemlerini sağlar ve belirli bir hücre tipi için radyoetiketleme protokolünde gerekli olabilecek değişiklikleri açıklar. Daha fazla netlik için, burada sunulan hücre radyo-etiketleme yöntemi dört bölüme ayrılmıştır. İlk bölüm, 89Zr’yi DFO-Bn-NCS ile şelatlayarak [89Zr]Zr-DBN’nin hazırlanması ile ilgilidir. İkinci bölüm, hücre radyo-etiketleme için kolayca kullanılabilen [89Zr]Zr-DBN’nin biyouyumlu bir formülasyonunun hazırlanmasını açıklar. Üçüncü bölüm, radyo-etiketleme için hücrelerin ön koşullandırılması için gereken adımları kapsar. Hücrelerin ön koşullandırılması, hücrelerin proteinsiz fosfat tamponlu salin (PBS) ve HEPES tamponlu Hanks dengeli tuz çözeltisi (H-HBSS) ile yıkanmasını içerir, bu da [89Zr] Zr-DBN’nin radyoetiketleme sırasında hücre yüzey proteinlerinde bulunan birincil aminlerle reaksiyonuna müdahale edebilir veya bunlarla rekabet edebilir. Son bölüm, hücrelerin gerçek radyo-etiketleme ve kalite kontrol analizi ile ilgili adımları sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşağıdakiler, etkili hücre radyo-etiketleme için optimizasyona ihtiyaç duyan protokoldeki kritik adımlardır. Protokol adımları 1.2 ve 1.3’te, kullanılan [89 Zr]Zr(HPO 4)2 veya [89Zr]ZrCl4 hacmine bağlı olarak, uygun bir hacim (mikrolitre) baz kullanılmalıdır; [89Zr]Zr(HPO4)2’nin nötralizasyonu için 1.0 MK2CO3çözeltisi ve 7.5-8.0 pH aralığına ulaşmak için [89Zr]ZrCl4’ün nötralizasyonu için 1.0 M<s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 ve DOE DE-SC0008947 hibeleri, Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı, Viyana, Mayo Clinic Nükleer Tıp Bölümü, Radyoloji Anabilim Dalı ve Mayo Clinic Rejeneratif Tıp Merkezi, Rochester, MN tarafından desteklenmiştir. Tüm figürler BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
| Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
| Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
| Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
| Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
| Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
| Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
Referencias
- Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
- Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
- Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
- Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
- Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
- Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
- Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
- Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
- Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
- Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
- Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
- Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
- Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
- Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
- Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
- Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
- Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
- Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
- Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
- Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
- Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
- Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
- Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
- Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
- Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
- Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
- Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
- Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
- de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).
