מודלים אורתוטופיים תרגומיים של גליובלסטומה מולטיפורמה
Summary
במאמר זה אנו מתארים מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני עבור GBM, שהוקם על ידי הזרקה תוך-גולגולתית של תאים שמקורם בגידולי מודל עכבר מהונדסים גנטית. מודל זה מציג את סימני ההיכר של המחלה של GBM אנושי. עבור מחקרים תרגומיים, הגידול במוח העכבר נמצא במעקב על ידי MRI in vivo והיסטופתולוגיה.
Abstract
מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) עבור גליובלסטומה מולטיפורמה אנושית (GBM) הם קריטיים להבנת ההתפתחות וההתקדמות של גידולי מוח. שלא כמו גידולי xenograft, ב- GEMs, גידולים מתעוררים במיקרו-סביבה הטבעית בעכבר כשיר חיסון. עם זאת, השימוש ב- GBM GEMs במחקרי טיפול פרה-קליניים מאתגר בשל השהיות ארוכות של גידולים, הטרוגניות בתדירות הניאופלזמה ועיתוי התפתחות הגידול בדרגה מתקדמת. עכברים המושרים באמצעות הזרקה אורתוטופית תוך גולגולתית ניתנים יותר למחקרים פרה-קליניים, ושומרים על מאפיינים של גידולי GEM. יצרנו מודל גידול מוח אורתוטופי הנגזר ממודל GEM עם סטיות Rb, Kras ו-p53 (TRP), המפתח גידולי GBM המציגים מוקדים ליניאריים של נמק על ידי תאים ניאופלסטיים, וכלי דם צפופים המקבילים ל-GBM אנושי. תאים שמקורם בגידולי GBM מסוג GEM מוזרקים תוך גולגולתית לעכברים מושתלים מסוג בר ומותאמים לזנים ומרבים גידולים בדרגה IV, ובכך עוקפים את תקופת החביון הארוכה של הגידול בעכברי GEM ומאפשרים יצירת קבוצות גדולות וניתנות לשחזור למחקרים פרה-קליניים. המאפיינים הרבים, החודרניים וכלי הדם של מודל TRP GEM עבור GBM משוחזרים בגידולים האורתוטופיים, וסמנים היסטופתולוגיים משקפים תת-קבוצות GBM אנושיות. צמיחת הגידול מנוטרת על ידי סריקות MRI סדרתיות. בשל האופי הפולשני של גידולים תוך גולגולתיים במודלים חיסוניים, מעקב קפדני אחר הליך ההזרקה המתואר כאן חיוני למניעת צמיחת גידול מחוץ לגולגולת.
Introduction
גליובלסטומה (GBM; גליומה דרגה IV) היא הגידול השכיח והממאיר ביותר במוח, והטיפולים הנוכחיים אינם יעילים, וכתוצאה מכך הישרדות חציונית של 15 חודשים1. מודלים פרה-קליניים אמינים ומדויקים המייצגים את מסלולי האיתות המורכבים המעורבים בצמיחת גידולי מוח ופתוגנזה חיוניים כדי לזרז את ההתקדמות בהערכת משטרים טיפוליים חדשים עבור GBM. מודלים עכבריים שבהם שורות תאי גידול במוח האנושי מושתלים באופן תת-עורי בעכברים מדוכאי חיסון אינם משקפים את הסביבה החיסונית הטבעית של גידולי מוח, וגם לא ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את יכולתם של טיפולים לחצות את מחסום הדם-מוח2. באופן אידיאלי, מודלים פרה-קליניים של עכברים צריכים גם לשחזר מקרוב את ההיסטופתולוגיה האנושית של GBM, כולל הרמה הגבוהה של פולשניות לתוך פרנכימה3 שמסביב. למרות שמודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) מפתחים גידולים בהקשר של מערכת חיסון שלמה, לעתים קרובות נדרשות תוכניות רבייה מסובכות, וגידולים עלולים להתפתח לאט ולא באופן עקבי4. מודלים של אלוגרפט שמקורם ב-GEM מתאימים יותר למחקרים טיפוליים פרה-קליניים, שבהם יש צורך בקבוצות גדולות של עכברים נושאי גידול במסגרת זמן קצרה יותר.
בדו”ח קודם, תיארנו מודל עכבר GBM אורתוטופי הנגזר ישירות מגידולי GEM. גידולים ב-GEM נובעים מאירועים גנטיים באוכלוסיות תאים (בעיקר אסטרוציטים) המבטאים חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), הגורמים להתקדמות לגליובלסטומה. אבני חן TRP אלה מכילות טרנסגן TgGZT121 (T), המבטא T121 לאחר חשיפה לרקומבינאז Cre מונע GFAP. ביטוי חלבון T121 גורם לדיכוי פעילות החלבון Rb (Rb1, p107 ו-p103). ביטוי משותף של טרנסגן Cre מונע GFAP (GFAP-CreERT2) מכוון ביטוי לאסטרוציטים בוגרים לאחר השראת טמוקסיפן. עכברי TRP מחזיקים גם בקראס מוטנטי תלוי Cre (KrasG12D; R) אלל, המייצגים הפעלה של מסלול הקולטן טירוזין קינאז, והם הטרוזיגוטיים לאובדן Pten (P)5,6. סטיות גנים מקבילות ברשתות הקולטן טירוזין קינאז (RTK), PI3K ו-RB מעורבות ב-74% מפתוגנזה7 של GBM. לכן, מסלולי האיתות העיקריים שהשתנו בגליובלסטומה אנושית מיוצגים על ידי המוטציות המהונדסות בעכברי TRP, במיוחד גידולי GBM, שבהם מופעלות מטרות משותפות במורד הזרם של RTK5.
המודל האורתוטופי הסינגני שמקורו ב-GEM אומת כמודל המשחזר מאפיינים של גידולי מוח אנושיים, כולל פולשניות ונוכחות של סמנים ביולוגיים תת-סוגיים, לשימוש כפלטפורמה להערכת טיפולים בסרטן המתמקדים במסלולים חריגים בגליובלסטומה. תאים גודלו בתרבית מגידולים שנקצרו ממוחות TRP והושתלו מחדש במוחם של עכברים מותאמי זן, תוך שימוש בציוד סטריאוטקטי להזרקה תוך גולגולתית בקליפת המוח. מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני זה פיתח גידולי GBM שהיו תאיים מאוד, פולשניים, פלאומורפיים עם קצב מיטוטי גבוה, והציגו מוקדים ליניאריים של נמק על ידי תאים ניאופלסטיים וכלי דם צפופים, כפי שנצפה עבור GBM אנושי. נפחי הגידול וצמיחתו נמדדו על ידי דימות תהודה מגנטית in vivo (MRI).
בדו”ח זה, אנו מתארים את הטכניקה האופטימלית להזרקה תוך גולגולתית של תאי GBM ראשוניים או קווי תאים לתוך מוח עכבר מסוג פראי, תוך שימוש בגידולי TRP כדוגמה. אותו פרוטוקול עשוי להיות מותאם לעכברים מדוכאי חיסון ולקווי תאים אחרים של GBM. טיפים חיוניים ניתנים למניעת מלכודות נפוצות, כגון הכנת תאים תת-אופטימלית או דליפת תאים באתר ההזרקה, ולשימוש נכון בציוד הסטריאוטקטי כדי להבטיח שחזור ואמינות של המודל. למטרות תרגומיות, אנו מאמתים את המודל על ידי זיהוי MRI של גידול גידולי מוח בבעלי חיים חיים, אפיון היסטולוגי, ומציגים דוגמה לטיפול בעכברים נושאי גידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים פרה-קליניים חיוניים להערכת מטרות טיפוליות חדשות ואסטרטגיות טיפול חדשניות בגליובלסטומה. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית עבור GBM הם בעלי יתרון של הופעת הגידול באתר האוטוכתוני, אך לעתים קרובות עם חביון ארוך וצמיחת גידול בלתי צפויה13. גידולי מודל GEM מציגים שיהוי של 4-5 חודשי…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה למר אלן א. קולאגה על הסיוע הטכני המצוין ולגב’ מישל ל. גומפרכט על שליטוש טכניקות הניתוח. אנו מודים לד”ר פיליפ ל. מרטין על ניתוח פתולוגיה ולגב’ ליליה אילבה וד”ר ג’וזף קלן מהתוכנית הלאומית לדימות בעלי חיים קטנים במעבדה הלאומית פרדריק עבור סריקות MRI.
פרויקט זה מומן במלואו או בחלקו במימון פדרלי מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה מס’ HHSN261201500003I. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם אזכור שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים אינו מרמז על תמיכה מצד ממשלת ארה”ב.
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referencias
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
