Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Summary

Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.

Abstract

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) para glioblastoma multiforme humano (GBM) são críticos para a compreensão do desenvolvimento e progressão de tumores cerebrais. Ao contrário dos tumores de xenoenxerto, nos GEMs, os tumores surgem no microambiente nativo em um camundongo imunocompetente. No entanto, o uso de GEMs GBM em estudos de tratamento pré-clínico é desafiador devido às longas latências tumorais, à heterogeneidade na frequência de neoplasias e ao momento do desenvolvimento de tumores de grau avançado. Camundongos induzidos por injeção ortotópica intracraniana são mais tratáveis para estudos pré-clínicos e mantêm características dos tumores GEM. Geramos um modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de um modelo de GEM com aberrações de Rb, Kras e p53 (TRP), que desenvolve tumores de GBM exibindo focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa análoga à GBM humana. Células derivadas de tumores GEM GBM são injetadas intracranialmente em camundongos selvagens e cepas compatíveis e reproduzem tumores de grau IV, contornando assim o longo período de latência tumoral em camundongos GEM e permitindo a criação de coortes grandes e reprodutíveis para estudos pré-clínicos. As características altamente proliferativas, invasivas e vasculares do modelo TRP GEM para GBM são recapituladas nos tumores ortotópicos, e os marcadores histopatológicos refletem subgrupos humanos de GBM. O crescimento do tumor é monitorado por exames seriados de RM. Devido à natureza invasiva dos tumores intracranianos em modelos imunocompetentes, seguir cuidadosamente o procedimento de injeção descrito aqui é essencial para prevenir o crescimento de tumores extracranianos.

Introduction

O glioblastoma (GBM; glioma grau IV) é o tumor cerebral mais comum e maligno, e as terapias atuais são ineficazes, resultando em uma sobrevida média de 15^meses1. Modelos pré-clínicos confiáveis e precisos que representem as complexas vias de sinalização envolvidas no crescimento e patogênese de tumores cerebrais são essenciais para acelerar o progresso na avaliação de novos regimes terapêuticos para GBM. Modelos murinos nos quais linhagens celulares tumorais cerebrais humanas são implantadas subcutaneamente em camundongos imunocomprometidos não refletem o ambiente imune nativo de tumores cerebrais, nem podem ser usados para avaliar a capacidade da terapêutica de atravessar a barreira hematoencefálica². Idealmente, modelos pré-clínicos em camundongos também devem reproduzir de perto a histopatologia do GBM humano, incluindo o alto nível de invasividade no parênquima circundante³. Embora modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) desenvolvam tumores no contexto de um sistema imunológico intacto, esquemas de melhoramento complicados são frequentemente necessários, e os tumores podem se desenvolver lenta e inconsistentemente⁴. Os modelos de aloenxerto derivados do GEM são mais adequados para estudos terapêuticos pré-clínicos, onde grandes coortes de camundongos portadores de tumor são necessárias em um período de tempo mais curto.

Em um relato anterior, descrevemos um modelo ortotópico de GBM em camundongos derivado diretamente de tumores GEM. A tumorigênese no GEM é iniciada por eventos genéticos em populações celulares (principalmente astrócitos) expressando proteína glial fibrilar ácida (GFAP), que resultam em progressão para GBM. Esses GEMs TRP abrigam um transgene (T) TgGZT121, que expressa T121 após exposição à recombinase Cre dirigida por GFAP. A expressão da proteína T121 resulta na supressão da atividade da proteína Rb (Rb1, p107 e p103). A co-expressão de um transgene Cre dirigido por GFAP (GFAP-CreERT2) tem como alvo a expressão para astrócitos adultos após indução com tamoxifeno. Camundongos TRP também abrigam um mutante Cre-dependente Kras (Kras^G12D; R) alelos, para representar a ativação da via do receptor tirosina quinase, e são heterozigotos para a perda de Pten (P)^5,6. Aberrações gênicas concomitantes nas redes de receptores tirosina quinase (RTK), PI3K e RB estão implicadas em 74% da patogênese do GBM⁷. Portanto, as vias de sinalização primárias alteradas no GBM humano são representadas pelas mutações projetadas em camundongos TRP, em particular tumores GBM, nos quais alvos compartilhados a jusante de RTKs são^ativados5.

O modelo ortotópico singênico derivado do GEM foi validado como um modelo que recapitula características de tumores cerebrais humanos, incluindo invasividade e presença de biomarcadores de subtipo, para uso como uma plataforma para avaliar a terapêutica do câncer visando vias aberrantes no GBM. As células foram cultivadas a partir de tumores colhidos de cérebros de TRP e reimplantadas no cérebro de camundongos pareados por cepas, usando equipamentos estereotáxicos para injeção intracraniana no córtex. Este modelo ortotópico pré-clínico em camundongos desenvolveu tumores de GBM altamente celulares, invasivos, pleomórficos com alta taxa mitótica, e exibiam focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa, como observado para GBM humano. O volume e o crescimento tumoral foram medidos por ressonância magnética (RM) in vivo .

Neste relato, descrevemos a técnica ideal para a injeção intracraniana de células GBM primárias ou linhagens celulares no cérebro selvagem de camundongos, usando tumores TRP como exemplo. O mesmo protocolo pode ser adaptado para camundongos imunocomprometidos e outras linhagens celulares GBM. Dicas cruciais são dadas para evitar armadilhas comuns, como preparação celular subótima ou vazamento celular no local da injeção, e para usar o equipamento estereotáxico corretamente para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade do modelo. Para fins translacionais, validamos o modelo por RM de detecção de crescimento de tumor cerebral em animais vivos, caracterização histológica, e apresentamos um exemplo de tratamento em camundongos portadores de tumor.

Protocol

O protocolo de estudo aqui descrito foi aprovado pelo NCI do Frederick Animal Care and Use Committee. O NCI-Frederick é acreditado pela AAALAC International e segue a Política do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cuidados com os animais foram realizados de acordo com os procedimentos descritos no “Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; A National Academies Press, Washington D.C.). 1. Preparação de c…

Representative Results

Camundongos injetados com células tumorais cerebrais devem ser monitorados diariamente em busca de sinais de crescimento tumoral, como convulsões, ataxia ou perda de peso. O crescimento do tumor cerebral também pode ser monitorado por ressonância magnética em intervalos regulares. A RM semanal permite a visualização do aumento da carga tumoral no interior do encéfalo e das medidas de volume tumoral (Figura 1C). Em particular, os tumores de TRP exibem crescimento agressivo, e os volum…

Discussion

Modelos pré-clínicos são essenciais para a avaliação de novos alvos terapêuticos e novas estratégias de tratamento no GBM. Modelos de camundongos geneticamente modificados para GBM têm a vantagem da ocorrência de tumores no sítio autóctone, mas muitas vezes com longa latência e crescimento tumoral^{imprevisível13}. Os tumores modelo GEM exibem uma latência de 4-5 meses, e a janela de tempo ideal para imagem, recrutamento e tratamento é variável entre camundongos individuais. O modelo …

Materials

5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T