Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Summary

Qui, descriviamo un modello murino ortotopico preclinico per GBM, stabilito mediante iniezione intracranica di cellule derivate da tumori modello murino geneticamente modificati. Questo modello mostra le caratteristiche della malattia del GBM umano. Per gli studi traslazionali, il tumore cerebrale del topo viene monitorato mediante risonanza magnetica in vivo e istopatologia.

Abstract

I modelli murini geneticamente modificati (GEM) per il glioblastoma multiforme umano (GBM) sono fondamentali per comprendere lo sviluppo e la progressione dei tumori cerebrali. A differenza dei tumori xenotrapianti, nei GEM, i tumori sorgono nel microambiente nativo in un topo immunocompetente. Tuttavia, l’uso di GEM GBM negli studi di trattamento preclinico è impegnativo a causa delle lunghe latenze tumorali, dell’eterogeneità nella frequenza delle neoplasie e dei tempi di sviluppo del tumore di grado avanzato. I topi indotti tramite iniezione ortotopica intracranica sono più trattabili per gli studi preclinici e mantengono le caratteristiche dei tumori GEM. Abbiamo generato un modello di tumore cerebrale ortotopico derivato da un modello GEM con aberrazioni Rb, Kras e p53 (TRP), che sviluppa tumori GBM che mostrano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa analoga al GBM umano. Le cellule derivate dai tumori GEM GBM vengono iniettate per via intracranica in topi riceventi wild-type, con ceppo abbinato e riproducono tumori di grado IV, bypassando così il lungo periodo di latenza tumorale nei topi GEM e consentendo la creazione di coorti ampie e riproducibili per studi preclinici. Le caratteristiche altamente proliferative, invasive e vascolari del modello TRP GEM per GBM sono ricapitolate nei tumori ortotopici e i marcatori istopatologici riflettono i sottogruppi di GBM umano. La crescita del tumore è monitorata da scansioni MRI seriali. A causa della natura invasiva dei tumori intracranici nei modelli immunocompetenti, seguire attentamente la procedura di iniezione qui descritta è essenziale per prevenire la crescita del tumore extracranico.

Introduction

Il glioblastoma (GBM; glioma di grado IV) è il tumore cerebrale più comune e maligno e le terapie attuali sono inefficaci, con una sopravvivenza mediana di 15 mesi¹. Modelli preclinici affidabili e accurati che rappresentano le complesse vie di segnalazione coinvolte nella crescita e nella patogenesi del tumore cerebrale sono essenziali per accelerare i progressi nella valutazione di nuovi regimi terapeutici per GBM. I modelli murini in cui le linee cellulari di tumore cerebrale umano sono impiantate per via sottocutanea in topi immunocompromessi non riflettono l’ambiente immunitario nativo dei tumori cerebrali, né possono essere utilizzati per valutare la capacità delle terapie di attraversare la barriera emato-encefalica². Idealmente, i modelli murini preclinici dovrebbero anche riprodurre fedelmente l’istopatologia GBM umana, incluso l’alto livello di invasività nel parenchima circostante³. Sebbene i modelli murini geneticamente modificati (GEM) sviluppino tumori nel contesto di un sistema immunitario intatto, sono spesso necessari schemi di allevamento complicati e i tumori possono svilupparsi lentamente e in modo incoerente⁴. I modelli di allotrapianto derivati da GEM sono più adatti per studi terapeutici preclinici, in cui sono necessarie grandi coorti di topi portatori di tumore in un lasso di tempo più breve.

In un precedente rapporto, abbiamo descritto un modello murino ortotopico GBM derivato direttamente dai tumori GEM. La tumorigenesi nel GEM è iniziata da eventi genetici in popolazioni cellulari (principalmente astrociti) che esprimono la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), che provocano la progressione verso GBM. Questi TRP GEM ospitano un transgene TgGZT121 (T), che esprime T121 dopo l’esposizione alla Cre ricombinasi guidata da GFAP. L’espressione della proteina T121 determina la soppressione dell’attività della proteina Rb (Rb1, p107 e p103). La co-espressione di un transgene Cre guidato da GFAP (GFAP-CreERT2) mira all’espressione degli astrociti adulti dopo induzione con tamoxifene. I topi TRP ospitano anche un Kras mutante Cre-dipendente (Kras^G12D; R) allele, per rappresentare l’attivazione della via del recettore tirosin-chinasi, e sono eterozigoti per la perdita di Pten (P)^5,6. Aberrazioni geniche concomitanti nelle reti del recettore tirosin-chinasi (RTK), PI3K e RB sono implicate nel 74% della patogenesi GBM⁷. Pertanto, le vie primarie di segnalazione alterate nel GBM umano sono rappresentate dalle mutazioni ingegnerizzate nei topi TRP, in particolare nei tumori GBM, in cui vengono attivati bersagli a valle condivisi di RTK⁵.

Il modello ortotopico singeneico derivato da GEM è stato convalidato come modello che riassume le caratteristiche dei tumori cerebrali umani, tra cui l’invasività e la presenza di biomarcatori di sottotipo, da utilizzare come piattaforma per valutare le terapie antitumorali mirate a percorsi aberranti nel GBM. Le cellule sono state coltivate da tumori raccolti dal cervello TRP e reimpiantate nel cervello di topi abbinati al ceppo, utilizzando apparecchiature stereotassiche per l’iniezione intracranica nella corteccia. Questo modello murino ortotopico preclinico ha sviluppato tumori GBM altamente cellulari, invasivi, pleomorfi con un alto tasso mitotico e mostravano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa, come osservato per GBM umano. I volumi e la crescita del tumore sono stati misurati mediante risonanza magnetica (MRI) in vivo .

In questo rapporto, descriviamo la tecnica ottimale per l’iniezione intracranica di cellule GBM primarie o linee cellulari nel cervello di topo wild-type, usando i tumori TRP come esempio. Lo stesso protocollo può essere adattato per topi immunocompromessi e altre linee cellulari GBM. Vengono forniti suggerimenti cruciali per evitare insidie comuni, come la preparazione non ottimale delle cellule o la perdita di cellule nel sito di iniezione, e per utilizzare correttamente l’apparecchiatura stereotassica per garantire la riproducibilità e l’affidabilità del modello. Per scopi traslazionali, convalidiamo il modello mediante rilevamento MRI della crescita del tumore cerebrale in animali vivi, caratterizzazione istologica e presentiamo un esempio di trattamento nei topi portatori di tumore.

Protocol

Il protocollo di studio qui descritto è stato approvato dal NCI presso il Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick è accreditato da AAALAC International e segue la politica del servizio sanitario pubblico per la cura e l’uso di animali da laboratorio. La cura degli animali è stata fornita secondo le procedure delineate nella “Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.). 1…

Representative Results

I topi iniettati con cellule tumorali cerebrali devono essere monitorati quotidianamente per segni di crescita tumorale come convulsioni, atassia o perdita di peso. La crescita del tumore cerebrale può anche essere monitorata mediante risonanza magnetica a intervalli regolari. Le scansioni MRI settimanali consentono la visualizzazione dell’aumento del carico tumorale all’interno del cervello e le misurazioni del volume del tumore (Figura 1C). In particolare, i tumori TRP mostrano una cresci…

Discussion

I modelli preclinici sono essenziali per la valutazione di nuovi bersagli terapeutici e nuove strategie di trattamento nel GBM. I modelli murini geneticamente modificati per GBM hanno il vantaggio di insorgenza del tumore nel sito autoctono, ma spesso con una lunga latenza e una crescita tumorale imprevedibile¹³. I tumori del modello GEM mostrano una latenza di 4-5 mesi e la finestra temporale ideale per l’imaging, il reclutamento e il trattamento è variabile tra i singoli topi. Il modello ortoto…

Materials

5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T