胰腺组织解剖以分离活的单细胞
Summary
胰腺化生细胞是引起胰腺肿瘤的恶性细胞的前体。然而，分离完整的活胰腺细胞具有挑战性。在这里，我们提出了一种有效的胰腺组织解离方法。然后，这些细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维或三维共培养。
Abstract
胰腺包括两个主要系统：产生和分泌激素的内分泌系统，以及约占胰腺90%的外分泌系统，包括产生和分泌消化酶的细胞。消化酶在胰腺腺泡细胞中产生，储存在称为酶原的囊泡中，然后 通过 胰管释放到十二指肠中以启动代谢过程。腺泡细胞产生的酶可以杀死细胞或降解游离RNA。此外，腺泡细胞很脆弱，常见的解离方案会导致大量死细胞和游离蛋白酶和RNase。因此，胰腺组织消化的最大挑战之一是恢复完整和活的细胞，尤其是腺泡细胞。本文中介绍的协议显示了我们为满足这一需求而开发的两步方法。该方案可用于消化正常胰腺、包含癌前病变的胰腺或包含大量基质和免疫细胞的胰腺肿瘤。
Introduction
胰腺导管腺癌 （PDAC） 是最具侵袭性的癌症类型之一1.临床证据支持这样一种观点，即PDAC是由KRAS原癌基因2突变驱动的外分泌系统细胞（包括腺泡细胞）发展而来的。
胰腺肿瘤包括许多不同的细胞类型，并且已经证明恶性细胞仅占肿瘤质量的 20%-50%3。不同的细胞类型与上皮细胞相互作用，支持其转化，并促进肿瘤的形成和生长。早期事件导致腺泡化生，从而引起称为胰腺上皮内瘤变 （PanINs） 的微观病变，在某些情况下可发展为 PDAC4。
迫切需要研究这些相互作用并瞄准关键信号。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的方法，它以单细胞分辨率揭示基因表达，从而跟踪上皮细胞所经历的变化，从而能够探索胰腺癌的发展。
组织解剖和消化为单细胞是scRNA-seq实验的第一阶段。有几个因素使胰腺组织消化特别具有挑战性：i）腺泡细胞占胰腺的90%以上，腺泡细胞含有大量的消化酶，包括蛋白酶和RNase，这些酶会降低基于RNA的文库的质量;（ii） 腺泡细胞非常敏感，如果使用标准方案，可能会裂解;（iii） 腺泡细胞以非常高的水平表达少量基因。因此，如果这些细胞在实验过程中裂解，可能会污染观察到的其他细胞的基因表达谱;（iv） 从肿瘤中恢复的胰腺组织是结缔组织增生的，因此很难在不损伤细胞的情况下进行解剖。因此，尽管需要保持所有细胞类型的高活力，但腺泡细胞的大量和敏感性增加了额外的复杂性。这些因素给实现单细胞悬液带来了困难，该悬浮液的存活率超过80%，并且没有团块，这是scRNA-seq实验所需的。
在这里，我们开发了一种使用胰蛋白酶C和胶原酶P的方案，以及频繁的组织监测。这支持解离为单细胞，同时保持高活力以支持 scRNA-seq 实验的成功 5,6。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文中，我们提出了胰腺组织解离的方案。该方案简单易用，并提供了一种在恶性肿瘤过程（包括实体瘤）的不同阶段从胰腺组织中分离活单细胞的工具。在以前的研究中，不同类型的胶原酶被用来消化胰腺8,9。使用非常有效的胶原酶，如胶原酶D，可产生大量的免疫细胞和较低比例的上皮细胞。使用胶原酶P可以进行胰腺消化，适用于完整或肿瘤胰腺…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 Avital Sarusi-Portuguez 博士在数据分析方面的帮助，以及 Dror Kolodkin-Gal 博士在之前的研究中为建立协议提供的帮助。我们感谢Parnas实验室的所有过去和现在的成员。我们感谢 Gillian Kay 博士和 Michael Kanovsky 博士在编辑方面的帮助。该项目已获得以色列科学基金会资助（第 526/18 O.P.号）、Alex U. Soyka 计划和以色列癌症研究基金（研究职业发展奖）的资助。
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells’ heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
