생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부
Summary
췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.
Abstract
췌장에는 호르몬을 생산하고 분비하는 내분비계와 췌장의 약 90%를 차지하고 소화 효소를 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 외분비계의 두 가지 주요 시스템이 있습니다. 소화 효소는 췌장 아시나 세포에서 생성되어 자이모겐(zymogen)이라고 하는 소포에 저장되었다가 췌관을 통해 십이지장으로 방출되어 대사 과정을 시작합니다. 아시나 세포에서 생성된 효소는 세포를 죽이거나 cell-free RNA를 분해할 수 있습니다. 또한 아시나 세포는 깨지기 쉬우며, 일반적인 해리 프로토콜은 많은 수의 죽은 세포와 cell-free 프로테아제 및 RNase를 초래합니다. 따라서 췌장 조직 소화의 가장 큰 과제 중 하나는 온전하고 생존 가능한 세포, 특히 아시나 세포를 회복하는 것입니다. 이 문서에 제시된 프로토콜은 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 개발한 2단계 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 정상 췌장, 전악성 병변을 포함하는 췌장 또는 많은 수의 기질 및 면역 세포를 포함하는 췌장 종양을 소화하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
췌관 선암(PDAC)은 가장 공격적인 암 유형중 하나입니다 1. 임상적 증거는 PDAC가 KRAS 원발암유전자2의 돌연변이에 의해 수년에 걸쳐 아시나 세포를 포함한 외분비 시스템 세포에서 발생한다는 개념을 뒷받침합니다.
췌장 종양에는 다양한 세포 유형이 포함되며, 악성 세포는 종양 질량의 20%-50%에 불과하다는 것이 입증되었습니다3. 다양한 세포 유형이 상피 세포와 상호 작용하여 형질전환을 지원하며 종양 형성 및 성장을 촉진합니다. 초기 사건은 췌장 상피내 종양(PanIN)이라고 하는 미세한 병변을 유발하는 침상 상피화생을 유발하며, 경우에 따라 PDAC4로 발전할 수 있습니다.
이러한 상호 작용을 조사하고 중추적인 신호를 목표로 삼아야 합니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 단일 세포 분해능으로 유전자 발현을 밝혀 상피 세포가 겪는 변화를 추적하여 췌장암 발병을 탐색할 수 있는 강력한 방법입니다.
단일 세포에 대한 조직 절개 및 분해는 scRNA-seq 실험의 첫 번째 단계입니다. 몇 가지 요인이 췌장 조직 소화를 특히 어렵게 만듭니다: i) 아시나 세포는 췌장의 90% 이상을 차지하고 아시나 세포는 RNA 기반 라이브러리의 품질을 떨어뜨리는 프로테아제 및 RNase를 포함한 많은 양의 소화 효소를 함유하고 있습니다. (ii) 아시나 세포는 매우 민감하며 표준 프로토콜을 사용하는 경우 용해될 수 있습니다. (iii) 아시나 세포는 매우 높은 수준에서 소수의 유전자를 발현합니다. 따라서 이러한 세포가 실험 중에 용해되면 다른 세포의 관찰된 유전자 발현 프로파일을 오염시킬 수 있습니다. (iv) 종양에서 회수된 췌장 조직은 탈형성(desmoplastic)이기 때문에 세포를 손상시키지 않고는 절개하기 어렵다. 따라서 모든 세포 유형의 높은 생존율을 유지하는 것이 필요하지만 아시나 세포의 많은 수와 감도는 복잡성을 더합니다. 이러한 요인은 scRNA-seq 실험에 필요한 것처럼 80% 이상 생존 가능하고 응집이 없는 단일 세포 현탁액을 달성하는 데 어려움을 초래합니다.
여기서는 빈번한 조직 모니터링과 함께 트립신 C와 콜라겐분해효소 P를 사용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이는 scRNA-seq 실험 5,6의 성공을 지원하기 위해 높은 생존력을 유지하면서 단일 세포로의 해리를 지원합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 글에서는 췌장 조직 해리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 간단하고 사용하기 쉬우며 고형 종양을 포함한 악성 종양 과정의 여러 단계에서 췌장 조직에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 도구를 제공합니다. 이전 연구에서는 췌장을 소화하기 위해 다양한 유형의 콜라겐 분해 효소가 사용되었습니다 8,9. 콜라겐분해효소 D와 같은 매우 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
데이터 분석에 도움을 주신 Avital Sarusi-Portuguez 박사와 이전 연구에서 프로토콜을 확립하는 데 도움을 주신 Dr. Dr. Kolodkin-Gal에게 감사드립니다. 파르나스 연구소의 모든 과거와 현재 구성원에게 감사드립니다. 편집에 도움을 주신 Gillian Kay 박사님과 Michael Kanovsky 박사님께 감사드립니다. 이 프로젝트는 이스라엘 과학 재단 보조금(No. 526/18 O.P.), Alex U. Soyka 프로그램 및 이스라엘 암 연구 기금(Research Career Development Award)의 보조금을 받았습니다.
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells’ heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
