Рассечение тканей поджелудочной железы для выделения жизнеспособных единичных клеток
Summary
Метапластические клетки поджелудочной железы являются предшественниками злокачественных клеток, которые дают начало опухолям поджелудочной железы. Тем не менее, выделение неповрежденных жизнеспособных клеток поджелудочной железы является сложной задачей. Здесь мы представляем эффективный метод диссоциации тканей поджелудочной железы. Затем клетки могут быть использованы для секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) или для двух- или трехмерного совместного культивирования.
Abstract
Поджелудочная железа включает в себя две основные системы: эндокринную, которая вырабатывает и секретирует гормоны, и экзокринную систему, которая составляет примерно 90% поджелудочной железы и включает клетки, вырабатывающие и секретирующие пищеварительные ферменты. Пищеварительные ферменты вырабатываются в ацинарных клетках поджелудочной железы, хранятся в везикулах, называемых зимогенами, а затем высвобождаются в двенадцатиперстную кишку через проток поджелудочной железы для запуска метаболических процессов. Ферменты, продуцируемые ацинарными клетками, могут убивать клетки или разрушать внеклеточную РНК. Кроме того, ацинарные клетки хрупки, и общие протоколы диссоциации приводят к большому количеству мертвых клеток и внеклеточных протеаз и РНКаз. Таким образом, одной из самых больших проблем в переваривании тканей поджелудочной железы является восстановление неповрежденных и жизнеспособных клеток, особенно ацинарных клеток. Протокол, представленный в этой статье, показывает двухэтапный метод, который мы разработали для удовлетворения этой потребности. Протокол может быть использован для переваривания нормальной поджелудочной железы, поджелудочной железы, которые включают предраковые поражения, или опухолей поджелудочной железы, которые включают большое количество стромальных и иммунных клеток.
Introduction
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых агрессивных типов рака1. Клинические данные подтверждают представление о том, что PDAC развивается из клеток экзокринной системы, включая ацинарные клетки, в течение многих лет, что обусловлено мутациями в протоонкогене KRAS2.
Опухоли поджелудочной железы включают в себя множество различных типов клеток, и было продемонстрировано, что злокачественные клетки составляют только 20-50% массы опухоли. Различные типы клеток взаимодействуют с эпителиальными клетками, поддерживают их трансформацию и усиливают образование и рост опухолей. Ранние события вызывают ацинарную метаплазию, которая приводит к микроскопическим поражениям, называемым интраэпителиальной неоплазией поджелудочной железы (PanINs), которые в некоторых случаях могут перерасти в PDAC4.
Существует острая необходимость в исследовании этих взаимодействий и нацеливании на ключевые сигналы. Секвенирование РНК одной клетки (scRNA-seq) является мощным методом, который выявляет экспрессию генов с разрешением одной клетки, тем самым отслеживая изменения, которые претерпевают эпителиальные клетки, что позволяет исследовать развитие рака поджелудочной железы.
Рассечение тканей и их расщепление на отдельные клетки является первым этапом эксперимента scRNA-seq. Несколько факторов делают пищеварение тканей поджелудочной железы особенно сложным: i) ацинарные клетки составляют более 90% поджелудочной железы, а ацинарные клетки содержат большое количество пищеварительных ферментов, включая протеазы и РНКазы, которые снижают качество библиотек на основе РНК; (ii) ацинарные клетки очень чувствительны и могут лизироваться при использовании стандартных протоколов; (iii) Ацинарные клетки экспрессируют небольшое количество генов на очень высоких уровнях. Поэтому, если эти клетки лизировать во время эксперимента, это может привести к контаминации наблюдаемого профиля экспрессии генов других клеток; (iv) ткань поджелудочной железы, извлеченная из опухолей, является десмопластической, что затрудняет ее вскрытие без повреждения клеток. Таким образом, несмотря на то, что требуется поддержание высокой жизнеспособности всех типов клеток, большое количество и чувствительность ацинарных клеток добавляют дополнительную сложность. Эти факторы затрудняют получение одноклеточной суспензии, жизнеспособной более чем на 80% и не имеющей скоплений, как это требуется для экспериментов scRNA-seq.
Здесь мы разработали протокол с использованием трипсина С и коллагеназы Р, а также частого мониторинга тканей. Это поддерживает диссоциацию на одиночные клетки, сохраняя при этом высокую жизнеспособность, что способствует успеху экспериментов scRNA-seq 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем протокол диссоциации тканей поджелудочной железы. Протокол прост, удобен в использовании и предоставляет инструмент для выделения жизнеспособных единичных клеток из ткани поджелудочной железы на разных стадиях злокачественного процесса, включая солидн…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Авиталь Саруси-Португес за помощь в анализе данных и д-ра Дрора Колодкина-Гала за помощь в создании протокола в предыдущем исследовании. Мы благодарим всех бывших и нынешних сотрудников лаборатории «Парнас». Благодарим д-ра Джиллиан Кей и д-ра Майкла Кановски за помощь в редактировании. Этот проект получил финансирование за счет гранта Израильского научного фонда (No 526/18 O.P.), программы Алекса У. Сойки и гранта Израильского фонда исследования рака (Research Career Development Award).
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells’ heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
