פקקת עורקים המושרה על ידי ברזל כלוריד ואיסוף דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תלת ממדי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בפציעה בתיווך FeCl3 כדי לגרום לפקקת עורקים, וכיצד לאסוף ולהכין דגימות פגיעה עורקית בשלבים שונים של פקקת לצורך ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים.
Abstract
מחלות לב וכלי דם הן גורם מוביל לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. פקקת חריגה היא תכונה נפוצה של מצבים סיסטמיים כמו סוכרת והשמנת יתר, ומחלות דלקתיות כרוניות כמו טרשת עורקים, סרטן ומחלות אוטואימוניות. בעת פגיעה בכלי הדם, בדרך כלל מערכת הקרישה, טסיות הדם והאנדותל פועלים באופן מתוזמר למניעת דימום על ידי יצירת קריש במקום הפגיעה. הפרעות בתהליך זה מובילות לדימום מוגזם או פקקת בלתי מבוקרת / פעילות אנטי-טרומבוטית לא מספקת, המתורגמת לחסימת כלי דם ולהמשך שלה. מודל פציעת התרדמה המושרה על ידי FeCl3 הוא כלי רב ערך בחקירת האופן שבו פקקת מתחילה ומתקדמת in vivo. מודל זה כולל נזק/דנודציה של אנדותל והיווצרות קריש דם לאחר מכן באתר הפגוע. הוא מספק בדיקה כמותית רגישה ביותר לניטור נזק לכלי דם והיווצרות קריש דם בתגובה לדרגות שונות של נזק לכלי הדם. לאחר אופטימיזציה של טכניקה סטנדרטית זו, ניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס פקקת, כמו גם את השינויים האולטרה-מבניים בטסיות הדם בפקקת הולכת וגדלה. בדיקה זו שימושית גם כדי ללמוד את היעילות של סוכני antithrombotic ו antiplatelet. מאמר זה מסביר כיצד ליזום ולנטר פקקת עורקים FeCl3 וכיצד לאסוף דגימות לניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים.
Introduction
פקקת היא היווצרות של קריש דם שחוסם באופן חלקי או מלא כלי דם, ומעכב את הזרימה הטבעית של הדם. זה מוביל לאירועים קרדיווסקולריים חמורים וקטלניים, כגון מחלת לב איסכמית ושבץ. מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה, וגורמות לאחד מכל ארבעה מקרי מוות ברחבי העולם 1,2,3. למרות פקקת מתבטאת כתפקוד לקוי של מערכת כלי הדם, זה יכול להיות תוצאה של זיהום מיקרוביאלי או ויראלי הבסיסי, הפרעה חיסונית, ממאירות, או מצב מטבולי. זרימת הדם נשמרת על ידי אינטראקציה מורכבת בין מרכיבים שונים של מערכת כלי הדם, כולל תאי אנדותל, תאי דם אדומים/לבנים, טסיות דם וגורמי קרישה4. במקרה של פגיעה בכלי הדם, טסיות הדם מתקשרות עם חלבוני הדבק על המטריצה התת-אנדותלית ומשחררות את תכולתן הגרגירית, אשר מגייסת יותר טסיות5. במקביל, מפל הקרישה מופעל, המוביל להיווצרות פיברין ותצהירו. בסופו של דבר, נוצר קריש דם, המכיל טסיות דם ותאי דם אדומים הכלואים בתוך רשת פיברין6. למרות שתרופות נוגדות טסיות ונוגדות קרישה זמינות כדי לווסת פקקת, דימום מזויף נותר דאגה מרכזית בטיפולים אלה, הדורשים כוונון עדין של המינונים והשילובים של תרופות אלה. לכן, יש עדיין צורך דחוף לגלות תרופות אנטי טרומבוטיות חדשות7.
פקקת נחקרת במספר שיטות לגרימת פגיעה בכלי הדם: מכנית (קשירת כלי דם), תרמית (פגיעה בלייזר) ופגיעה כימית (FeCl3/Rose Bengal application). אופי הפקקת משתנה בהתאם למיקום (עורקי לעומת ורידי), שיטה או היקף הפגיעה. בין כל הסוגים הללו, FeCl 3-induced vascular injury היא השיטה הנפוצה ביותר. הוא שימש בעכברים, חולדות, ארנבות, שרקנים וכלבים 8,9,10,11,12. השיטה פשוטה יחסית, קלה לשימוש, ואם הפרמטרים העיקריים מתוקננים, היא רגישה וניתנת לשחזור במערכות כלי דם שונות (למשל, עורקים [קרוטיד ועצם הירך], ורידים [jugular] ועורקים [cremaster ו mesenteric]) (טבלה משלימה 1).
מודל זה יכול לשמש גם כדי לקדם את הבנתנו את המכניקה והמורפולוגיה של היווצרות קרישי דם. טכניקה זו מציעה באופן ייחודי את היתרון של עצירת פקקת בנקודות קצב זרימה שונות, כדי ללמוד את שלבי הביניים של התהליך לפני שהוא הופך להיות חוסם. ההתקדמות האחרונה במחקר פקקת השתמשה במודל זה כדי למקד את תשומת הלב בשיטות לא פרמקולוגיות של טרומבוליזה13 או משלוח לא פולשני של חומרים אנטי טרומבוטיים ו / או פיברינוליטיים14,15. מספר קבוצות הראו כי כאשר קרומי טסיות הדם מצופות בטיפולים אלה, ניתן להפעיל את התרופות בגירוי תרמי כדי להתמקד בקרישי דם16. הטכניקות המתוארות כאן יכולות להיות שימושיות למחקרים כגון אימות ממצאיהם ברמת טסיות הדם היחידה. בכתב יד זה, פרוטוקול 1 מתאר את ההליך הבסיסי של פגיעה בכלי דם בתיווך FeCl3, ואילו פרוטוקול 2 מתאר את השיטה לאסוף ולתקן את דגימת הפגיעה בכלי הדם לניתוח נוסף במיקרוסקופ אלקטרונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
היישום המקומי של FeCl3 בכלי הדם כדי לגרום לפקקת הוא טכניקה נפוצה, והיא סייעה בקביעת תפקידים עבור קולטני טסיות שונים, מסלולי איתות ליגנד, ומעכביהם20,21,22,23. המנגנון שבאמצעותו FeCl3 גורם פקקת הוא רב פנים; בעבר, דנודצי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחברי מעבדת לב לבן על העיון המדוקדק בכתב היד הזה. העבודה נתמכה על ידי מענקים מה-NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 ו-HL150818), ופרס הצטיינות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים ל-S.W.W., R01 HL 155519 ל-B.S., ומענק תוכנית NIBIB ל-R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Referencias
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
