Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D
Summary
Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l’analisi al microscopio elettronico.
Abstract
Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La trombosi aberrante è una caratteristica comune di condizioni sistemiche come il diabete e l’obesità e malattie infiammatorie croniche come l’aterosclerosi, il cancro e le malattie autoimmuni. In caso di lesione vascolare, di solito il sistema di coagulazione, le piastrine e l’endotelio agiscono in modo orchestrato per prevenire il sanguinamento formando un coagulo nel sito della lesione. Le anomalie in questo processo portano a sanguinamento eccessivo o trombosi incontrollata / insufficiente attività antitrombotica, che si traduce in occlusione dei vasi e sue sequele. Il modello di danno carotidea indotto da FeCl3 è uno strumento prezioso per sondare come la trombosi inizia e progredisce in vivo. Questo modello comporta danni endoteliali / denudazione e successiva formazione di coaguli nel sito danneggiato. Fornisce un test quantitativo altamente sensibile per monitorare il danno vascolare e la formazione di coaguli in risposta a diversi gradi di danno vascolare. Una volta ottimizzata, questa tecnica standard può essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della trombosi, nonché i cambiamenti ultrastrutturali nelle piastrine in un trombo in crescita. Questo test è utile anche per studiare l’efficacia degli agenti antitrombotici e antipiastrinici. Questo articolo spiega come avviare e monitorare la trombosi arteriosa indotta da FeCl3 e come raccogliere campioni per l’analisi mediante microscopia elettronica.
Introduction
La trombosi è la formazione di un coagulo di sangue che blocca parzialmente o completamente un vaso sanguigno, impedendo il flusso naturale del sangue. Ciò porta a eventi cardiovascolari gravi e fatali, come cardiopatia ischemica e ictus. Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità e causano un decesso su quattro in tutto il mondo 1,2,3. Sebbene la trombosi si manifesti come un malfunzionamento del sistema vascolare, potrebbe essere il risultato di un’infezione microbica o virale sottostante, di un disturbo immunitario, di un tumore maligno o di una condizione metabolica. Il flusso di sangue è mantenuto dalla complessa interazione tra diversi componenti del sistema vascolare, tra cui cellule endoteliali, globuli rossi / bianchi, piastrine e fattori della coagulazione4. In caso di danno vascolare, le piastrine interagiscono con le proteine adesive sulla matrice subendoteliale e rilasciano il loro contenuto granulare, che recluta più piastrine5. Contemporaneamente, viene attivata la cascata della coagulazione, portando alla formazione e alla deposizione di fibrina. In definitiva, si forma un coagulo, contenente piastrine e globuli rossi intrappolati all’interno di una maglia di fibrina6. Sebbene siano disponibili farmaci antiaggreganti piastrinici e anticoagulanti per modulare la trombosi, il sanguinamento spurio rimane una delle principali preoccupazioni con queste terapie, che richiedono la messa a punto dei dosaggi e delle combinazioni di questi farmaci. Pertanto, vi è ancora un urgente bisogno di scoprire nuovi farmaci antitrombotici7.
La trombosi viene studiata utilizzando diversi metodi per infliggere lesioni vascolari: lesioni meccaniche (legatura dei vasi), termiche (lesioni laser) e chimiche (applicazione FeCl3 / Rose Bengal). La natura della trombosi varia a seconda della posizione (arteriosa vs venosa), del metodo o dell’estensione della lesione. Tra tutti questi tipi, il danno vascolare indotto da FeCl3 è il metodo più utilizzato. È stato impiegato in topi, ratti, conigli, porcellini d’India e cani 8,9,10,11,12. Il metodo è relativamente semplice, facile da usare e, se i parametri principali sono standardizzati, è sensibile e riproducibile in vari sistemi vascolari (ad esempio, arterie [carotide e femorale], vene [giugulare] e arteriole [cremaster e mesenterico]) (Tabella supplementare 1).
Questo modello può anche essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della meccanica e della morfologia della formazione dei coaguli. Questa tecnica offre unicamente il vantaggio di fermare la trombosi in vari punti di portata, per studiare le fasi intermedie del processo prima che diventi occlusivo. I recenti progressi nella ricerca sulla trombosi hanno utilizzato questo modello per focalizzare l’attenzione su metodi non farmacologici di trombolisi13 o somministrazione non invasiva di agenti antitrombotici e/o fibrinolitici14,15. Diversi gruppi hanno dimostrato che, quando le membrane piastriniche sono rivestite con queste terapie, i farmaci possono essere attivati dopo stimolazione termica per colpire i coaguli16. Le tecniche qui descritte possono essere utili per studi come la convalida dei loro risultati a livello piastrinico singolo. In questo manoscritto, il Protocollo 1 descrive la procedura di base di danno vascolare mediata da FeCl3, mentre il Protocollo 2 descrive il metodo per raccogliere e fissare il campione di danno vascolare per ulteriori analisi mediante microscopia elettronica.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’applicazione topica di FeCl3 al sistema vascolare per indurre trombosi è una tecnica ampiamente utilizzata ed è stata determinante nello stabilire ruoli per vari recettori piastrinici, vie di segnalazione del ligando e loro inibitori20,21,22,23. Il meccanismo attraverso il quale FeCl3 provoca trombosi è sfaccettato; In precedenza, la denudazione endoteliale era consid…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i membri del Whiteheart Laboratory per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Il lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818) e un Department of Veterans Affairs Merit Award a S.W.W., R01 HL 155519 a BS e NIBIB intramural program grant a R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Referencias
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