El presente protocolo describe cómo utilizar una lesión mediada por FeCl3 para inducir trombosis arterial, y cómo recoger y preparar muestras de lesión arterial en diversas etapas de trombosis para el análisis de microscopía electrónica.
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Artículo de método
Trombosis arterial inducida por cloruro férrico y recolección de muestras para análisis de microscopía electrónica 3D
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La trombosis aberrante es una característica común de afecciones sistémicas como la diabetes y la obesidad, y enfermedades inflamatorias crónicas como la aterosclerosis, el cáncer y las enfermedades autoinmunes. Tras una lesión vascular, generalmente el sistema de coagulación, las plaquetas y el endotelio actúan de manera orquestada para prevenir el sangrado formando un coágulo en el sitio de la lesión. Las anomalías en este proceso conducen a sangrado excesivo o trombosis incontrolada / actividad antitrombótica insuficiente, lo que se traduce en oclusión de los vasos y sus secuelas. El modelo de lesión carotídea inducida por FeCl3 es una herramienta valiosa para investigar cómo se inicia y progresa la trombosis in vivo. Este modelo implica daño endotelial/denudación y posterior formación de coágulos en el sitio lesionado. Proporciona un ensayo cuantitativo altamente sensible para monitorear el daño vascular y la formación de coágulos en respuesta a diferentes grados de daño vascular. Una vez optimizada, esta técnica estándar se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la trombosis, así como los cambios ultraestructurales en las plaquetas en un trombo en crecimiento. Este ensayo también es útil para estudiar la eficacia de los agentes antitrombóticos y antiplaquetarios. Este artículo explica cómo iniciar y monitorear la trombosis arterial inducida por FeCl3 y cómo recolectar muestras para su análisis por microscopía electrónica.
Introducción
La trombosis es la formación de un coágulo de sangre que bloquea parcial o completamente un vaso sanguíneo, impidiendo el flujo natural de la sangre. Esto conduce a eventos cardiovasculares graves y fatales, como cardiopatía isquémica y accidentes cerebrovasculares. Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad, y causan una de cada cuatro muertes en todo el mundo 1,2,3. Aunque la trombosis se manifiesta como un mal funcionamiento del sistema vascular, podría ser el resultado de una infección microbiana o viral subyacente, un trastorno in....
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Protocolo
Todos los experimentos discutidos aquí fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kentucky.
NOTA: Los instrumentos quirúrgicos se enumeran en la Figura 1 y en la Tabla de materiales. Se utilizaron ratones C57BL/6J, de 8-10 semanas de edad, machos/hembras o cepas genéticamente manipuladas relevantes (Knockout o Knockin).
1. Lesión de la arteria carótida inducida por FeCl3
- Inducción de anestesia en ratón
- Pesa el ratón.
- Anestesiar al ratón inye....
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Resultados
Los datos generalmente se presentan como tiempo hasta la oclusión, o tiempo requerido para formar un trombo completamente oclusivo. Estos datos se pueden trazar como una curva de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 4A)19, un diagrama de puntos con barras que muestran el flujo sanguíneo terminal en el momento del cese del flujo sanguíneo o la finalización de un experimento (Figura 4B), o como un gráfico de líneas (Figura 4C).
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Discusión
La aplicación tópica de FeCl3 a la vasculatura para inducir trombosis es una técnica ampliamente utilizada, y ha sido fundamental para establecer roles para varios receptores plaquetarios, vías de señalización de ligandos y sus inhibidores20,21,22,23. El mecanismo a través del cual FeCl3 causa trombosis es multifacético; Anteriormente, la denudación endotelial era consider.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este estudio.
Perfiles ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Whiteheart por su cuidadosa lectura de este manuscrito. El trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 y HL150818), y un Premio al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos a S.W.W., R01 HL 155519 a B.S., y una subvención del programa intramuros NIBIB a R.D.L.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.9% Solución salina | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl utilizado para hacer una solución de solución salina al 0,9% |
| Jeringa de 1 ml | Becton, Dickinson y Compañía | ||
| 190 Etanol de prueba | KOPTEC | V1101 | Se utiliza para hacer una solución de etanol al 70% para usar en la preparación del ratón para la cirugía |
| 2,2,2 Tribromoetanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| Sutura de seda trenzada negra de 25 yardas (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Aguja | Becton, Dickinson y Compañía | 305110 | |
| 2-metil-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| pipeta de transferencia de 7,5 mL, graduada a 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Almohadillas de preparación con alcohol (70% de alcohol isopropílico) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Servicios de microscopía electrónica | 10900 | |
| Plato de cultivo celular de 35 mm x 10 mm | Corning Incorporated | ||
| Báscula compacta | Ciencia de Ward | 470314-390 | |
| Tijeras de disección, 12,5 cm de largo | Instrumento de precisión mundial | 15922-G | |
| DMP-30 activador | Servicios de microscopía electrónica | 13600 | |
| Anhídrido succínico de dodenilo/ DDSA | Servicios de microscopía electrónica | 13700 | |
| Bolsas de caca de perro/bolsa de eliminación de cadáveres de animales | Productos de la corona | PP-RB-200 | |
| Sonda de flujo Doppler | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resina | Servicios de microscopía electrónica | 14900 | |
| Alcohol etílico, anhidro de 200 grados | Servicios de microscopía electrónica | 15055 | |
| Pinza de apósito para ojos, 4" completamente curvada, estándar, puntas de 0,8 mm de ancho | Integra Miltex | 18-784 | |
| Papel de filtro | VWR | 28310-106 | |
| Tijeras finas - Herramientas de ciencia fina afiladas y romas | 14028-10 | ||
| Punzones de oreja con lazo para dedos | Herramientas de Bellas Ciencias | 24212-01 | |
| Esponjas de gasa 2" x 2" y 12 capas; | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehído (solución al 10%)Servicios de | microscopía electrónica | 16120 | |
| Integra Miltex Cuchilla Quirúrgica de Acero al Carbono #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Cloruro de hierro (III) | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Mango de cuchillo Miltex® Acero inoxidable extrafino tamaño 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| Ácido L-aspártico | Sigma Pescador | A93100 | |
| Ácido L-aspártico | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Nitrato de plomo | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscopio | LEICA | Ya no está disponible | no está disponible en la empresa |
| LEICA S8AP0 Microscopio Stand | LEICA | 10447255 | Ya no está disponible en la empresa |
| Limpiadores de pañuelos ligeros | VWR | 82003-822 | |
| Pinzas de microdisección; 1x2 dientes, curva completa; 0,8 mm de ancho de punta; 4" de longitud | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Solución acuosa de tetróxido de osmio al 4% | Servicios de microscopía electrónica | 19150 | |
| Paraformaldehído (solución al 16%)Servicios de | microscopía electrónica | 15710 | |
| Ferricianuro de potasio | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Óxido de propileno, reactivo ACS | Servicios de microscopía electrónica | 20401 | |
| Pipeta Rainin Classic PR-10 | Caudalímetro de investigación Rainin | 17008649 | |
| Sistemas Transónicos Inc. | T402B01481 | Modelo: T402 | |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | ||
| Almohadilla térmica para animales pequeños | K& H Manufactura Inc. | Modelo: HM10 | |
| Tampón de cacodilato de sodio 0.2M, pH7.4 | Servicios de microscopía electrónica | 11623 | |
| Aplicadores estériles con punta de algodón | Productos médicos puritanos | 25-806 1WC | |
| Iluminador Steromaster | Fisher Scientific | 12-562-21 | Ya no está disponible en la compañía |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Herramientas de Bellas Ciencias | 11271-30 | |
| Tiocarbohidrazida (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Recargas universales de punta de pipeta de baja retención (0.1-10 y micro; L) | VWR | 76323-394 | |
| acetato de uranilo | 22400 | ||
| Veet Gel Crema Depilador | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| Blanco Bote de Pesaje Hexagonal Antiestático, Mediano, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software para Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Versión 3.38 | Disponible gratuitamente para descargar. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Referencias
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
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Reimpresiones y permisos
