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Medicina

염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64985
, , , , , , , , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology,University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering,National Institutes of Health

Summary

본 프로토콜은 동맥 혈전증을 유도하기 위해 FeCl3 매개 손상을 사용하는 방법, 및 전자 현미경 분석을 위해 혈전증의 다양한 단계에서 동맥 손상 샘플을 수집하고 준비하는 방법을 설명합니다.

Abstract

심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 비정상적인 혈전증은 당뇨병 및 비만과 같은 전신 질환과 죽상동맥경화증, 암 및 자가면역 질환과 같은 만성 염증성 질환의 일반적인 특징입니다. 혈관 손상 시 일반적으로 응고계, 혈소판 및 내피가 조율된 방식으로 작용하여 손상 부위에 혈전을 형성하여 출혈을 예방합니다. 이 과정의 이상은 과도한 출혈 또는 조절되지 않는 혈전증/불충분한 항혈전 활성으로 이어져 혈관 폐색 및 후유증으로 이어집니다. FeCl3 유도 경동맥 손상 모델은 생체 내에서 혈전증이 어떻게 시작되고 진행되는지 조사하는 데 유용한 도구입니다. 이 모델은 손상 부위의 내피 손상/탈락 및 후속 혈전 형성을 포함합니다. 다양한 정도의 혈관 손상에 대한 반응으로 혈관 손상 및 혈전 형성을 모니터링하기 위해 매우 민감한 정량적 분석을 제공합니다. 일단 최적화되면, 이 표준 기술은 혈전증의 기저에 있는 분자 메커니즘과 성장하는 혈전에서 혈소판의 미세구조적 변화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 분석은 또한 항혈전제 및 항혈소판제의 효능을 연구하는 데 유용합니다. 이 기사에서는 FeCl3 유도 동맥 혈전증을 시작하고 모니터링하는 방법과 전자 현미경으로 분석할 샘플을 수집하는 방법을 설명합니다.

Introduction

혈전증은 혈관을 부분적으로 또는 완전히 차단하여 혈액의 자연스러운 흐름을 방해하는 혈전의 형성입니다. 이것은 허혈성 심장 질환 및 뇌졸중과 같은 심각하고 치명적인 심혈관 사건으로 이어집니다. 심혈관 질환은 이환율과 사망률의 주요 원인이며 전 세계적으로 4명 중 1명이 사망합니다 1,2,3. 혈전증은 혈관계 기능 장애로 나타나지만 기저 미생물 또는 바이러스 감염, 면역 장애, 악성 종양 또는 대사 상태의 결과일 수 있습니다. 혈액의 흐름은 혈관 내피 세포, 적혈구/백혈구, 혈소판, 응고인자 등 혈관계의 다양한 구성 요소들 간의 복잡한 상호작용에 의해 유지된다4. 혈관 손상 시, 혈소판은 내피하 기질의 접착 단백질과 상호작용하여 과립 내용물을 방출하여 더 많은 혈소판을 모집한다5. 동시에 응고 캐스케이드가 활성화되어 피브린 형성 및 침착을 유발합니다. 궁극적으로, 혈소판과 적혈구가 피브린 메쉬(fibrin mesh) 내에 갇혀있는 혈전이 형성된다 6. 혈전증을 조절하기 위해 항혈소판제 및 항응고제를 사용할 수 있지만 가짜 출혈은 이러한 요법의 주요 관심사로 남아 있으며 이러한 약물의 복용량과 조합을 미세 조정해야 합니다. 따라서, 새로운 항혈전제를 발견하는 것이 여전히 시급하다7.

혈전증은 기계적 손상(혈관 결찰), 열적 손상(레이저 손상) 및 화학적 손상(FeCl3/로즈 벵골 적용)과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 연구됩니다. 혈전증의 성격은 부상의 위치(동맥 대 정맥), 방법 또는 정도에 따라 다릅니다. 이러한 모든 유형 중에서 FeCl3 유발 혈관 손상이 가장 널리 사용되는 방법입니다. 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그 및 개 8,9,10,11,12에 사용되었습니다. 이 방법은 비교적 간단하고 사용하기 쉬우며 주요 매개변수가 표준화되면 다양한 혈관계(예: 동맥[경동맥 및 대퇴골], 정맥[경정맥] 및 세동맥[크레마스터 및 장간막])에서 민감하고 재현 가능합니다(보충 표 1).

이 모델은 또한 혈전 형성의 역학과 형태에 대한 이해를 높이는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 유속 지점에서 혈전증을 멈추고 폐색되기 전에 공정의 중간 단계를 연구할 수 있는 이점을 제공합니다. 혈전증 연구의 최근 발전은 이 모델을 사용하여 혈전용해의 비약리학적 방법13 또는 항혈전 및/또는 섬유소 용해제의 비침습적 전달에 주의를 집중시켰다14,15. 몇몇 연구진은 혈소판막이 이러한 치료제로 코팅될 때, 혈전을 표적으로 하는 열 자극에 의해 약물이 활성화될 수 있음을 보여주었다16. 여기에 설명된 기술은 단일 혈소판 수준에서 결과를 검증하는 것과 같은 연구에 유용할 수 있습니다. 이 원고에서 프로토콜 1은 기본적인 FeCl3 매개 혈관 손상 절차를 설명하는 반면, 프로토콜 2는 전자 현미경에 의한 추가 분석을 위해 혈관 손상 샘플을 수집하고 고정하는 방법을 설명합니다.

Protocol

여기에서 논의된 모든 실험은 켄터키 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인했습니다. 참고: 수술 기구는 그림 1 과 재료 표에 나와 있습니다. C57BL/6J 마우스, 8-10주령, 수컷/암컷 또는 관련 유전자 조작(Knockout 또는 Knockin) 균주를 사용했습니다. 1. FeCl3 유발 경동맥 손상 <…

Representative Results

데이터는 일반적으로 폐색까지의 시간 또는 완전 폐색 혈전을 형성하는 데 필요한 시간으로 표시됩니다. 이러한 데이터는 Kaplan-Meier 생존 곡선(그림 4A)19, 혈류 중단 또는 실험 종료 시점의 최종 혈류를 보여주는 막대가 있는 도트 플롯(그림 4B) 또는 선 그래프(그림 4C)로 표시할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 ?…

Discussion

혈전증을 유도하기 위해 맥관 구조에 FeCl3 를 국소 적용하는 것은 널리 사용되는 기술이며 다양한 혈소판 수용체, 리간드 신호 전달 경로 및 그 억제제20,21,22,23에 대한 역할을 확립하는 데 도움이되었습니다. FeCl3 가 혈전증을 일으키는 메커니즘은 다각적입니다. 이전에는 내피 탈락이…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 이 원고를 주의 깊게 정독한 Whiteheart Laboratory 회원들에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NIH, NHLBI(HL56652, HL138179 및 HL150818)의 보조금과 SWW에 대한 재향 군인회 공로상, BS에 R01 HL 155519, RDL에 대한 NIBIB 교내 프로그램 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

0.9% Saline  Fisher Scientific  BP358-212 NaCl used to make a solution of 0.9% saline 
1 mL Syringe  Becton, Dickinson and Company  309659
190 Proof Ethanol  KOPTEC V1101  Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery 
2,2,2 Tribromoethanol Sigma Aldrich 48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) DEKNATEL 136082-1204
26G x 3/8 Needle  Becton, Dickinson and Company  305110
2-methyl-2-butanol Sigma Aldrich 240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL Globe Scientific Inc. 135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) Medline MDS090735
Araldite GY 502  Electron microscopy Services  10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm  Corning Incorporated  430165
Compact Scale  Ward's Science  470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long World Precision Instrument 15922-G
DMP-30 activator  Electron microscopy Services  13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA Electron microscopy Services  13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag Crown Products  PP-RB-200
Doppler FlowProbe Transonic Systems Inc. MA0.5PSB
EMBED 812 resin  Electron microscopy Services  14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof  Electron microscopy Services  15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips Integra Miltex 18-784
Filter Paper  VWR 28310-106
Fine Scissors – Sharp-Blunt Fine Science Tools  14028-10
Finger Loop Ear Punches  Fine Science Tools  24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply  Dukal Corporation 2128
Glutaraldehyde (10% solution) Electron microscopy Services  16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 Integra® Miltex® 4110
Iron (III) Chloride  SIGMA-ALDRICH 157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 Integra Lifesciences  157510
L-aspartic acid Sigma Fisher  A93100
L-aspartic acid Fisher Scientific  BP374-100
Lead Nitrate  Fisher Scientific  L-62
LEICA S8AP0 Microscope LEICA No longer available No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand  LEICA 10447255 No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers  VWR 82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical Instrument Company RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution  Electron microscopy Services  19150
Paraformaldehyde (16% solution) Electron microscopy Services  15710
Potassium ferricyanide SIGMA-ALDRICH P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent  Electron microscopy Services  20401
Rainin Classic Pipette PR-10 Rainin 17008649
Research Flowmeter  Transonic Systems Inc. T402B01481 Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear Scotch  305289
Small Animal Heated Pad K&H Manufacturing Inc. Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 Electron microscopy Services  11623
Sterile Cotton Tipped Applicators  Puritan Medical Products  25-806 1WC
Steromaster Illuminator  Fisher Scientific  12-562-21 No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps  Fine Science Tools  11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH) SIGMA-ALDRICH 88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) VWR 76323-394
Uranyl Acetate Electron microscopy Services  22400
Veet Gel Cream Hair Remover Reckitt Benckiser 3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm Fisher Scientific  S38975
WinDAQ/100 Software for Windows DATAQ Instruments, Inc. Version 3.38 Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1 ZEISS 57615
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Referencias

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Keywords: Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis3D Electron Microscopy AnalysisPlateletsHemostatic SystemThrombosisCarotid ArteryIron Chloride InjuryFlow MeasurementsFixativeElectron MicroscopyBlood Flow
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Joshi, S., Smith, A. N., Prakhya, K. S., Alfar, H. R., Lykins, J., Zhang, M., Pokrovskaya, I., Aronova, M., Leapman, R. D., Storrie, B., Whiteheart, S. W. Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis. J. Vis. Exp. (193), e64985, doi:10.3791/64985 (2023).
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