암의 마우스 모델에서 정맥 혈전증 분석
Summary
이 논문은 정맥 결찰을 달성하기 위해 혈관 클립을 사용하여 마우스 암 모델에서 정맥 혈전증을 평가하기 위한 최적화된 방법을 제시하는 것을 목표로 합니다. 최적화는 혈전증 관련 측정의 변동성을 최소화하고 인간 암 관련 정맥 혈전증과의 관련성을 향상시킵니다.
Abstract
이 방법론 논문은 특히 암 관련 혈전증(CAT)의 맥락에서 정맥 혈전증의 설치류 모델의 외과적 뉘앙스를 강조합니다. 심부 정맥 혈전증은 암 생존자에게 흔한 합병증이며 잠재적으로 치명적일 수 있습니다. 현재의 쥐 정맥 혈전증 모델은 일반적으로 봉합사를 사용하여 하대정맥(IVC)의 전체 또는 부분적인 기계적 폐색을 포함합니다. 이 시술은 혈액의 전체 또는 부분 정체와 내피 손상을 유도하여 혈전 형성을 유발합니다. 현재 모델은 혈전 중량의 높은 변동성, 상당한 사망률, 학습 곡선 연장과 같은 한계가 있습니다. 이 보고서에서는 이러한 한계 중 일부를 해결하기 위해 혈관 클립을 사용한 수술 개선법을 소개합니다. 합성 대장암 이종이식 마우스 모델을 사용하여 맞춤형 혈관 클립을 사용하여 대정맥을 결찰했습니다. 이 클립은 IVC 결찰 후 5-0 폴리프로필렌 봉합사와 유사한 잔류 립 공간을 허용합니다. 봉합사 방법을 사용한 마우스가 대조군으로 사용되었습니다. 혈관 클립법은 봉합사법보다 가변성이 적고 일관되게 재현 가능한 부분 혈관 폐색과 더 큰 응고 무게를 가져왔습니다. 더 큰 응고 중량, 더 큰 응고 질량 및 IVC 내강 표면적에 대한 응고는 6-0 폴리프로필렌 봉합사에 비해 혈관 클립의 더 높은 압력 프로파일로 인해 예상되었습니다. 이 접근법은 그레이 스케일 초음파에 의해 검증되었으며, 봉합 방법에 비해 혈관 클립이 있는 대정맥에서 일관되게 더 큰 혈전 덩어리를 보여주었습니다. 이러한 관찰은 면역형광 염색으로 더욱 입증되었습니다. 이 연구는 생쥐에서 정맥 혈전증 모델을 생성하는 개선된 방법을 제공하며, 이는 CAT의 기계론적 이해와 약물 발견과 같은 중개 연구에 사용할 수 있습니다.
Introduction
암 관련 정맥 혈전 색전증(VTE)
정맥혈전색전증(VTE) 위험은 암 생존자가 일반 인구에 비해 4-7배 더 높습니다 1,2,3. 이 질환은 암 환자 7명 중 1명에게 치명적이다. VTE의 발생률은 암의 종류와 종양 부담에 따라 다르며, 췌장암과 위암 환자에서 가장 높다4.
암 환자에서 암 관련 VTE는 예후적으로 중요합니다. 암 진단 후 첫 해에는 연령, 인종, 기저암의 병기를 조정한 후에도 전체 생존율이 좋지 않은 것으로 나타났다5. 이러한 발견은 암과 관련된 VTE를 검사하는 것의 중요성과 동물 모델을 사용하여 그 메커니즘을 조사해야 할 필요성을 강조합니다. 이 영역의 중개적 관련성은 암 환자에서 VTE가 혈전예방과 항혈전제 요법으로 예방되고 치료될 수 있다는 사실에 의해 더욱 강조된다6.
암 및 정맥 혈전증의 동물 모델
암 모델은 일반적으로 이종이식(xenograft)이라고 불리며, 이는 마우스에 암세포를 주입하는 것을 수반합니다. 원점과 같은 부위에 암세포를 주입하는 것을 orthotopic 모델이라고 하며, 다른 부위(옆구리의 피하 평면)에 주입하는 것을 이종성 모델이라고 합니다. 암세포의 기원 종은 HT-29 세포주(인간 결장암)7,8,9와 같은 동종 모델로 암세포를 결정합니다. 반대로, 합성 모델은 RenCa 및 MC-38 세포주 3,10을 포함하는 쥐 암 세포주를 사용합니다.
문헌은 설치류의 동맥, 정맥 및 모세혈관 혈전증 모델을 설명했습니다. 정맥 혈전증은 기계적 손상(가이드 와이어) 또는 완전 IVC 결찰, 화학적 손상(염화제2철) 또는 전해 손상에 의해 하대정맥(IVC)에서 유도됩니다. 염화제2철 유도 혈전증 또는 IVC 결찰은 완전한 폐색 모델을 나타냅니다. 후자는 혈액의 정체를 초래하고 염증성 혈관 침윤을 초래한다11,12,13. 완전한 결찰 모델은 마우스의 95%에서 100%에서 높은 혈전증 형성률을 초래합니다. 부분 IVC 결찰 모델은 외측 장요추 가지의 중단을 포함할 수 있으며, IVC12의 원위 표적 지점에 봉합사 결찰을 적용함으로써 정맥 복귀를 폐지합니다. 때때로, 공간 홀더는 정맥 복귀를 부분적으로 방해하기 위해 사용됩니다. 그러나, 혈전 무게는 현재의 부분 폐색 모델에서 일관되지 않으며, 그 결과 응고 무게와 높이에서 높은 변동성을 초래한다12,14.
이 두 가지 큰 정맥 기계 모델(부분 및 전체)에는 한계가 있습니다. 첫째, IVC 결찰술(정체 모델)은 종종 저혈압을 초래합니다. 혈액은 척추 정맥을 통해 흘러 들어갑니다. 경험이 풍부하지만 이 모델의 사망률은 5%-30%이며 학습 곡선 동안 더 높은 비율이 예상됩니다. 중요한 것은 완전한 폐색 모델은 일반적으로 혈전이 비폐색성인 인간의 심부정맥혈전증(DVT)을 재현하지 않는다는 것입니다. 완전한 폐색은 혈액 유변학적 요인과 약력학적 매개변수를 변경하여 국소 부위에서 화합물의 생체이용률을 변화시킬 수 있습니다. 이러한 한계로 인해, 완전한 교합 모델은 치료 목적과 약물 발견을 위한 새로운 화합물을 테스트하는 데 최적이 아닐 수 있다12.
내피 손상으로 인한 혈류 감소가 있는 정맥 혈전증의 임상적으로 보다 관련성 있는 쥐 모델을 제공하기 위해 내피 파괴가 없는 상태에서 혈류 제한에 의해 DVT가 유발되는 정맥 혈전증 모델이 도입되었습니다. 모델은 주사 전자 현미경15에 의해 검증되었습니다. 선호되는 임상적으로 관련된 혈전증 모델은 약물 발견을 가능하게 하는 거의 완전한 혈전증을 가진 모델입니다. 현재의 부분 교합 모델에서의 응고 형성은 일관되지 않으며, 그 결과 응고 무게와 높이에서 높은 변동성을 초래한다12,16. 더욱이, 응고 중량은 기존 방법으로는 가변적이어서 연구당 더 많은 마우스가 필요하다12.
이전의 암 관련 혈전증 모델은 결장암, 췌장암 및 폐암에 초점을 맞추었으며 모두 완전한 폐색 모델이었다17,18,19. 이 원고는 부분 폐색 혈전증 모델을 수정하여 가변성과 마우스 사망률이 낮은 혈전을 제공합니다(그림 1). 이전 연구에서는 면역이 손상된 흉선혈 마우스 배경 19,20,21에 동종 암 세포주를 사용했습니다. 이 원고는 C57Bl6/J 마우스에서 MC-38 세포 합성 이종이식을 사용하여 면역 능력이 있는 마우스를 사용하고 혈전 형성에 대한 면역 성분을 검사할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
합성 이종이식 대장암 모델에서는 대조군에 비해 실험군에서 더 높은 혈전성 및 응고 마커 발현을 관찰했습니다. 중요한 것은 이러한 모든 매개변수의 분산이 대조군에 비해 실험군에서 더 낮았다는 것입니다. 수정에는 IVC와 왼쪽 신장 정맥의 합류 지점에 특정 압력 프로파일이 있는 혈관 클립을 도입하는 것이 포함되었습니다. 클립은 5-0 폴리프로필렌 봉합사인 스페이서 위에 놓였습니다. 이 변…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center Grant 857078(KR, VCC, XY 및 SL) 및 R01HL166608(KR 및 VCC)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
Referencias
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