Test della trombosi venosa in un modello murino di cancro

Summary

Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo ottimizzato per la valutazione della trombosi venosa in un modello murino di cancro, utilizzando clip vascolari per ottenere la legatura venosa. L’ottimizzazione riduce al minimo la variabilità nelle misurazioni correlate alla trombosi e migliora la rilevanza per la trombosi venosa umana associata al cancro.

Abstract

Questo documento metodologico evidenzia le sfumature chirurgiche di un modello di trombosi venosa di roditore, in particolare nel contesto della trombosi associata al cancro (TAC). La trombosi venosa profonda è una complicanza comune nei sopravvissuti al cancro e può essere potenzialmente fatale. Gli attuali modelli di trombosi venosa murina comportano in genere un’occlusione meccanica completa o parziale della vena cava inferiore (IVC) utilizzando una sutura. Questa procedura induce una stasi totale o parziale del sangue e un danno endoteliale, innescando la trombogenesi. I modelli attuali presentano limitazioni come una maggiore variabilità nel peso dei coaguli, un tasso di mortalità significativo e una curva di apprendimento prolungata. Questo rapporto introduce perfezionamenti chirurgici utilizzando clip vascolari per affrontare alcune di queste limitazioni. Utilizzando un modello murino di xenotrapianto di cancro del colon singenico, abbiamo impiegato clip vascolari personalizzate per legare la vena cava infrarenale. Queste clip consentono uno spazio residuo per le labbra simile a una sutura in polipropilene 5-0 dopo le legature IVC. I topi con il metodo di sutura sono serviti come controlli. Il metodo della clip vascolare ha portato a un’occlusione vascolare parziale riproducibile e costante e a un peso del coagulo maggiore con una minore variabilità rispetto al metodo di sutura. Ci si aspettava che i pesi del coagulo maggiori, la maggiore massa del coagulo e il coagulo della superficie luminale dell’IVC fossero dovuti al profilo di pressione più elevato delle clip vascolari rispetto a una sutura in polipropilene 6-0. L’approccio è stato convalidato dall’ecografia in scala di grigi, che ha rivelato una massa di coaguli costantemente maggiore nella vena cava infrarenale con clip vascolari rispetto al metodo di sutura. Queste osservazioni sono state ulteriormente confermate dalla colorazione in immunofluorescenza. Questo studio offre un metodo migliorato per generare un modello di trombosi venosa nei topi, che può essere impiegato per approfondire la comprensione meccanicistica della CAT e nella ricerca traslazionale come la scoperta di farmaci.

Introduction

Tromboembolia venosa associata al cancro (TEV)
Il rischio di tromboembolia venosa (TEV) è da 4 a 7 volte più alto nei sopravvissuti al cancro rispetto alla popolazione generale ^1,2,3. Questa condizione si rivela fatale in un paziente su sette con cancro. L’incidenza di TEV varia a seconda del tipo di tumore e del carico tumorale ed è più alta tra i pazienti con tumori del pancreas e dello stomaco⁴.

Il TEV associato al cancro nei pazienti oncologici ha un significato prognostico. È associata a una sopravvivenza globale sfavorevole nel primo anno dopo una diagnosi di cancro, anche dopo aggiustamento per età, razza e stadio del cancro sottostante⁵. Questi risultati evidenziano l’importanza di esaminare il TEV associato al cancro e la necessità di sondare il suo meccanismo utilizzando un modello animale. La rilevanza traslazionale di quest’area è ulteriormente enfatizzata dal fatto che il TEV nei pazienti oncologici è prevenibile e curabile con la tromboprofilassi e la terapia antitrombotica⁶.

Modelli animali di cancro e trombosi venosa
I modelli di cancro sono convenzionalmente chiamati xenotrapianti, che comportano l’iniezione di cellule tumorali nei topi. L’iniezione di cellule tumorali in un sito come la sua origine è indicata come modello ortotopico, mentre in un sito diverso (piano sottocutaneo sul fianco) è nota come modello eterotopico. La specie di origine delle cellule tumorali le determina come modello allogenico, come la linea cellulare HT-29 (cancro del colon umano)^7,8,9. Al contrario, i modelli singetici utilizzano le linee cellulari tumorali murine, comprese le linee cellulari^RenCa e MC-38 ^3,10.

La letteratura ha descritto modelli di trombosi arteriosa, venosa e capillare nei roditori. La trombosi venosa è indotta nella vena cava inferiore (IVC) da una lesione meccanica (filo guida) o da una legatura IVC completa, chimica (cloruro ferrico) o da una lesione elettrolitica. La trombosi indotta da cloruro ferrico o la legatura IVC rappresentano modelli di occlusione completa. Quest’ultimo provoca la stasi del sangue e infiltrati infiammatori nelle vene^11,12,13. Il modello completo di legatura determina un alto tasso di formazione di trombosi nel 95-100% dei topi. Il modello di legatura parziale dell’IVC potrebbe includere l’interruzione dei rami ileolombari laterali e il ritorno venoso viene abrogato applicando legature di sutura nei punti target distali dell’IVC¹². A volte, un supporto di spazio viene utilizzato per interrompere parzialmente il ritorno venoso. Tuttavia, il peso del trombo è incoerente nell’attuale modello di occlusione parziale, con conseguente elevata variabilità nei pesi e nelle altezze dei coaguli^12,14.

Entrambi questi modelli meccanici a vena larga (parziale e completa) hanno dei limiti. In primo luogo, la legatura IVC (modello di stasi) spesso provoca ipotensione. Il sangue viene deviato attraverso le vene vertebrali. Anche se in mani esperte, la mortalità con questo modello varia dal 5% al 30%, con il tasso più alto previsto durante la curva di apprendimento. È importante sottolineare che il modello di occlusione completa non riproduce la trombosi venosa profonda (TVP) nell’uomo, dove un trombo è tipicamente non occlusivo. L’occlusione completa può alterare i fattori emorrologici e i parametri farmacodinamici, alterando la biodisponibilità dei composti nel sito locale. A causa di queste limitazioni, i modelli di occlusione completa potrebbero non essere ottimali per testare nuovi composti chimici per scopi terapeutici e scoperte farmacologiche¹².

Va notato che per fornire un modello murino di trombosi venosa clinicamente più rilevante con flusso ridotto con danno endoteliale, è stato introdotto un modello di trombosi venosa, in cui la TVP è innescata dalla restrizione del flusso sanguigno in assenza di interruzione endoteliale. Il modello è stato validato mediante microscopia elettronica a scansione¹⁵. Un modello di trombosi clinicamente rilevante preferito è quello con trombosi quasi completa che consente la scoperta di farmaci. La formazione di coaguli negli attuali modelli di occlusione parziale è incoerente, con conseguente elevata variabilità nel peso e nell’altezza del coagulo^12,16. Inoltre, il peso del coagulo è variabile con i metodi convenzionali, richiedendo più topi per studio¹².

I precedenti modelli di trombosi associata al cancro si concentravano sul cancro del colon, del pancreas e del polmone ed erano tutti modelli di occlusione completa^17,18,19. Questo manoscritto modifica il modello di trombosi a occlusione parziale per fornire coaguli con minore variabilità e mortalità nei topi (Figura 1). Studi precedenti hanno utilizzato linee cellulari tumorali allogeniche su topi atimici immunocompromessi 19,20,21. Questo manoscritto utilizza uno xenotrapianto di cellule singegene MC-38 in topi C57Bl6/J, che consente l’uso di topi immunocompetenti e l’esame delle componenti immunitarie per la trombogenesi.

Protocol

Per questo studio sono stati utilizzati 16 topi femmina C57Bl6/J, di età compresa tra 8 e 12 settimane e con un peso corporeo compreso tra 20 e 25 g. I topi sono stati alloggiati in condizioni standard e sono stati nutriti con cibo e acqua ad libitum. Questo studio è stato condotto con l’approvazione dell’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Boston University. Le procedure aperte qui descritte sono state eseguite in condizioni sterili. 1. Modello di xenotr…

Representative Results

A un gruppo di topi femmina C57Bl6/J, di età compresa tra 8 e 12 settimane, sono state iniettate cellule MC-38 nella fase logaritmica della crescita cellulare. Gli xenotrapianti sono cresciuti rapidamente tra la terza e la quarta settimana dopo l’iniezione18. Una volta che i tumori hanno raggiunto un volume medio di 400mm3, i topi sono stati randomizzati al gruppo di controllo e al gruppo sperimentale. Il gruppo di controllo è stato sottoposto a legatura IVC con sutura, mentre i topi …

Discussion

In un modello di carcinoma del colon xenotrapianto, osserviamo una maggiore trombogenicità ed espressione di marcatori della coagulazione nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo. È importante sottolineare che la varianza in tutti questi parametri era inferiore nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo. La modifica ha comportato l’introduzione di una clip vascolare con un profilo di pressione specifico nel punto di confluenza dell’IVC e della vena renale sinistra. La clip è stata posiziona…

Materials

Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors – Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01