Анализ венозного тромбоза на мышиной модели рака
Summary
Целью данной статьи является представление оптимизированного метода оценки венозного тромбоза в мышиной модели рака с использованием сосудистых зажимов для достижения венозной лигации. Оптимизация сводит к минимуму вариабельность измерений, связанных с тромбозом, и повышает актуальность для связанного с раком венозного тромбоза человека.
Abstract
В данной методологической работе освещаются хирургические нюансы модели венозного тромбоза на грызунах, особенно в контексте рак-ассоциированного тромбоза (КПП). Тромбоз глубоких вен является распространенным осложнением у людей, перенесших рак, и может привести к летальному исходу. Современные модели мышиного венозного тромбоза, как правило, включают полную или частичную механическую окклюзию нижней полой вены (IVC) с помощью шва. Эта процедура вызывает полный или частичный застой крови и повреждение эндотелия, запуская тромбогенез. Существующие модели имеют ограничения, такие как более высокая вариабельность веса сгустков, значительный уровень смертности и длительная кривая обучения. В этом отчете представлены хирургические усовершенствования с использованием сосудистых зажимов для устранения некоторых из этих ограничений. Используя модель сингенного ксенотрансплантата рака толстой кишки у мышей, мы использовали индивидуальные сосудистые зажимы для перевязки полой вены инфраренала. Эти клипсы обеспечивают остаточное пространство губы, аналогичное полипропиленовому шовному материалу 5-0 после лигирования IVC. Контрольной группой служили мыши с шовным методом. Метод зажима сосудов привел к последовательной воспроизводимой частичной окклюзии сосудов и большему весу сгустка с меньшей вариабельностью, чем метод наложения швов. Больший вес сгустка, большая масса сгустка и сгусток на поверхности просвета IVC были ожидаемы из-за более высокого профиля давления сосудистых зажимов по сравнению с полипропиленовым шовным материалом 6-0. Подход был подтвержден с помощью УЗИ в оттенках серого, которая выявила стабильно большую массу тромба в инфраренальной полой вене с сосудистыми зажимами по сравнению с шовным методом. Эти наблюдения были дополнительно подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Это исследование предлагает усовершенствованный метод создания модели венозного тромбоза у мышей, который может быть использован для углубления механистического понимания CAT и в трансляционных исследованиях, таких как разработка лекарств.
Introduction
Рак-ассоциированная венозная тромбоэмболия (ВТЭ)
Риск венозной тромбоэмболии (ВТЭ) в 4–7 раз выше у пациентов, перенесших рак, по сравнению с общей популяцией 1,2,3. Это состояние приводит к летальному исходу у каждого седьмого пациента с раком. Частота ВТЭ варьируется в зависимости от типа рака и опухолевой нагрузки и наиболее высока среди пациентов с раком поджелудочной железы и желудка4.
Рак-ассоциированная ВТЭ у онкологических больных имеет прогностическое значение. Это связано с неблагоприятной общей выживаемостью в течение первого года после постановки диагноза рака, даже с поправкой на возраст, расу и стадиюосновного рака. Эти результаты подчеркивают важность изучения ВТЭ, ассоциированной с раком, и необходимость изучения ее механизма на животной модели. Трансляционная значимость этого направления дополнительно подчеркивается тем фактом, что ВТЭ у онкологических больных можно предотвратить и лечить с помощью тромбопрофилактики и антитромботической терапии6.
Животные модели рака и венозного тромбоза
Модели рака условно называются ксенотрансплантатами, которые влекут за собой инъекцию раковых клеток мышам. Инъекция раковых клеток в том же месте, что и их источник, называется ортотопической моделью, в то время как в другом месте (подкожная плоскость над боком) известна как гетеротопическая модель. Вид происхождения раковых клеток определяет их как аллогенную модель, такую как клеточная линия HT-29 (рак толстой кишки человека)7,8,9. Напротив, в сингенных моделях используются линии мышиных раковых клеток, в том числе клеточные линии RenCa и MC-38 3,10.
В литературе описаны модели артериального, венозного и капиллярного тромбоза у грызунов. Венозный тромбоз индуцируется в нижней полой вене (НПВ) механическим повреждением (проводник) или полным лигированием НПВ, химическим (хлорид железа) или электролитическим повреждением. Тромбоз, индуцированный хлоридом железа, или лигирование IVC, представляет собой полную окклюзионную модель. Последнее приводит к застою крови и воспалительным инфильтратам в венах11,12,13. Модель полного лигирования приводит к высокой скорости образования тромбозов у 95–100% мышей. Модель частичного лигирования IVC может включать прерывание латеральных подвздошно-поясничных ветвей, а венозный возврат отменяется путем наложения шовных лигаторов в дистальных точках-мишенях IVC12. Иногда для частичного прерывания венозного возврата используется спейсхолдер. Тем не менее, вес тромба непостоянен в текущей модели частичной окклюзии, что приводит к высокой вариабельности веса и высоты тромба12,14.
Обе эти модели механической обработки крупных вен (частичная и полная) имеют ограничения. Во-первых, лигирование IVC (стазисная модель) часто приводит к гипотензии. Кровь шунтируется по позвоночным венам. Несмотря на то, что в опытных руках смертность с этой моделью колеблется от 5% до 30%, причем более высокий уровень ожидается во время кривой обучения. Важно отметить, что модель полной окклюзии не воспроизводит тромбоз глубоких вен (ТГВ) у людей, где тромб обычно является неокклюзионным. Полная окклюзия, вероятно, изменяет гемореологические факторы и фармакодинамические параметры, изменяя биодоступность соединений в локальном очаге. Из-за этих ограничений полные модели окклюзии могут быть неоптимальными для тестирования новых химических соединений в терапевтических целях и открытия лекарств12.
Следует отметить, что для получения более клинически значимой мышиной модели венозного тромбоза со сниженным током при повреждении эндотелия была введена модель венозного тромбоза, где ТГВ запускается ограничением кровотока при отсутствии эндотелиального разрушения. Валидацию модели проводили методом сканирующей электронной микроскопии15. Предпочтительной клинически значимой моделью тромбоза является модель с почти полным тромбозом, которая позволяет разрабатывать лекарственные препараты. Образование тромба в современных моделях частичной окклюзии непоследовательно, что приводит к высокой вариабельности веса и высоты сгустка12,16. Кроме того, вес сгустка варьируется при использовании традиционных методов, что требует большего количества мышей в исследованиях12.
Предыдущие модели тромбоза, ассоциированного с раком, были сосредоточены на раке толстой кишки, поджелудочной железы и легких и представляли собой модели полной окклюзии17,18,19. В данной рукописи модифицирована модель тромбоза частичной окклюзии, чтобы обеспечить более низкую вариабельность тромбов и смертность мышей (рис. 1). В предыдущих исследованиях использовались аллогенные линии раковых клеток на фоне 19,20,21 мышей с ослабленным иммунитетом. В данной работе используется сингенный ксенотрансплантат клеток MC-38 у мышей линии C57Bl6/J, что позволяет использовать иммунокомпетентных мышей и исследовать иммунные компоненты для тромбогенеза.
Protocol
Representative Results
Discussion
В сингенной модели рака толстой кишки с помощью сингенного ксенотрансплантата мы наблюдаем более высокую тромбогенность и экспрессию маркеров свертывания крови в опытной группе по сравнению с контрольной группой. Важно отметить, что дисперсия по всем этим параметрам была ниже в опыт?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Центра кардиоонкологии AHA SFRN CAT-HD GRANT 857078 (KR, VCC, XY и SL) и R01HL166608 (KR и VCC).
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
Referencias
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Investigación sobre el cáncer. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Investigación sobre el cáncer. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al. May-Thurner syndrome. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
