Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones

Summary

Este artículo tiene como objetivo presentar un método optimizado para evaluar la trombosis venosa en un modelo de cáncer de ratón, utilizando clips vasculares para lograr la ligadura venosa. La optimización minimiza la variabilidad en las mediciones relacionadas con la trombosis y mejora la relevancia para la trombosis venosa asociada al cáncer humano.

Abstract

En este trabajo metodológico se destacan los matices quirúrgicos de un modelo de trombosis venosa en roedores, específicamente en el contexto de la trombosis asociada al cáncer (TAC). La trombosis venosa profunda es una complicación común en los sobrevivientes de cáncer y puede ser potencialmente mortal. Los modelos actuales de trombosis venosa murina suelen implicar una oclusión mecánica completa o parcial de la vena cava inferior (VCI) mediante una sutura. Este procedimiento induce una estasis total o parcial de la sangre y daño endotelial, desencadenando la trombogénesis. Los modelos actuales tienen limitaciones, como una mayor variabilidad en el peso de los coágulos, una tasa de mortalidad significativa y una curva de aprendizaje prolongada. Este informe presenta mejoras quirúrgicas utilizando clips vasculares para abordar algunas de estas limitaciones. Utilizando un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de colon singénico, empleamos clips vasculares personalizados para ligar la vena cava infrarrenal. Estos clips permiten un espacio labial residual similar a una sutura de polipropileno 5-0 después de las ligaduras de VCI. Los ratones con el método de sutura sirvieron como controles. El método de clip vascular dio lugar a una oclusión vascular parcial consistente y reproducible y a un mayor peso de los coágulos con menos variabilidad que el método de sutura. Se esperaba que los pesos de coágulos más grandes, la mayor masa de coágulos y el coágulo en el área de superficie luminal de la VCI se deban al perfil de presión más alto de los clips vasculares en comparación con una sutura de polipropileno 6-0. El abordaje se validó mediante ecografía en escala de grises, que reveló una masa de coágulo consistentemente mayor en la vena cava infrarrenal con clips vasculares en comparación con el método de sutura. Estas observaciones se corroboraron aún más con la tinción de inmunofluorescencia. Este estudio ofrece un método mejorado para generar un modelo de trombosis venosa en ratones, que puede emplearse para profundizar en la comprensión mecanicista de la TAC y en la investigación traslacional, como el descubrimiento de fármacos.

Introduction

Tromboembolismo venoso asociado al cáncer (TEV)
El riesgo de tromboembolismo venoso (TEV) es de 4 a 7 veces mayor en los supervivientes de cáncer en comparación con la población general ^1,2,3. Esta afección resulta mortal en uno de cada siete pacientes con cáncer. La incidencia de TEV varía según el tipo de cáncer y la carga tumoral, y es mayor entre los pacientes con cáncer de páncreas y gástrico⁴.

El TEV asociado al cáncer en pacientes con cáncer tiene importancia pronóstica. Se asocia con una supervivencia general desfavorable en el primer año después de un diagnóstico de cáncer, incluso después de ajustar por edad, raza y estadio del cáncer subyacente⁵. Estos hallazgos ponen de relieve la importancia de examinar el TEV asociado al cáncer y la necesidad de investigar su mecanismo utilizando un modelo animal. La relevancia traslacional de esta área se acentúa aún más por el hecho de que el TEV en pacientes con cáncer es prevenible y tratable con tromboprofilaxis y terapia antitrombótica⁶.

Modelos animales de cáncer y trombosis venosa
Los modelos de cáncer se denominan convencionalmente xenoinjertos, que implican la inyección de células cancerosas en ratones. La inyección de células cancerosas en un sitio similar a su origen se conoce como modelo ortotópico, mientras que en un sitio diferente (plano subcutáneo sobre el flanco) se conoce como modelo heterotópico. La especie de origen de las células cancerosas las determina como modelo alogénico, como la línea celular HT-29 (cáncer de colon humano)^7,8,9. Por el contrario, los modelos singénicos utilizan las líneas celulares de cáncer murino, incluidas las líneas celulares RenCa y MC-38 ^3,10.

La literatura ha descrito modelos de trombosis arterial, venosa y capilar en roedores. La trombosis venosa es inducida en la vena cava inferior (VCI) por lesión mecánica (alambre guía) o ligadura completa de la VCI, química (cloruro férrico) o lesión electrolítica. La trombosis inducida por cloruro férrico o ligadura de VCI representa modelos de oclusión completa. Esto último resulta en la estasis de la sangre y los infiltrados inflamatorios en las venas^11,12,13. El modelo de ligadura completa da como resultado una alta tasa de formación de trombosis en el 95% al 100% de los ratones. El modelo de ligadura parcial de la VCI puede incluir la interrupción de las ramas iliolumbares laterales, y el retorno venoso se anula mediante la aplicación de ligaduras de sutura en los puntos diana distales de la VCI¹². A veces, se utiliza un soporte de espacio para interrumpir parcialmente el retorno venoso. Sin embargo, el peso del trombo es inconsistente en el modelo actual de oclusión parcial, resultando en una alta variabilidad en el peso de los coágulos y en las alturas^12,14.

Ambos modelos mecánicos de vetas grandes (parcial y completa) tienen limitaciones. En primer lugar, la ligadura de la VCI (modelo de estasis) suele provocar hipotensión. La sangre se desvía a través de las venas vertebrales. Aunque en manos experimentadas, la mortalidad con este modelo oscila entre el 5% y el 30%, y la tasa más alta se espera durante la curva de aprendizaje. Es importante destacar que el modelo de oclusión completa no reproduce la trombosis venosa profunda (TVP) en humanos, donde un trombo suele ser no oclusivo. Es probable que la oclusión completa altere los factores hemorreológicos y los parámetros farmacodinámicos, alterando la biodisponibilidad de los compuestos en el sitio local. Debido a estas limitaciones, los modelos de oclusión completa pueden no ser óptimos para probar nuevos compuestos químicos con fines terapéuticos y descubrimientos de fármacos¹².

Cabe señalar que para proporcionar un modelo murino clínicamente más relevante de trombosis venosa con flujo disminuido con daño endotelial, se ha introducido un modelo de trombosis venosa, donde la TVP se desencadena por la restricción del flujo sanguíneo en ausencia de disrupción endotelial. El modelo fue validado por microscopía electrónica de barrido¹⁵. Un modelo de trombosis clínicamente relevante preferido es aquel con trombosis casi completa que permite el descubrimiento de fármacos. La formación de coágulos en los modelos actuales de oclusión parcial es inconsistente, resultando en una alta variabilidad en el peso y la altura del coágulo^12,16. Además, el peso del coágulo es variable con los métodos convencionales, requiriendo más ratones por estudio¹².

Los modelos anteriores de trombosis asociada al cáncer se centraron en el cáncer de colon, páncreas y pulmón y todos fueron modelos de oclusión completa^17,18,19. Este manuscrito modifica el modelo de trombosis de oclusión parcial para proporcionar coágulos con menor variabilidad y mortalidad en ratones (Figura 1). Estudios anteriores utilizaron líneas celulares de cáncer alogénico en ratones atímicos inmunodeprimidos 19,20,21. Este manuscrito utiliza un xenoinjerto singénico de células MC-38 en ratones C57Bl6/J, que permite el uso de ratones inmunocompetentes y el examen de componentes inmunes a la trombogénesis.

Protocol

Para este estudio, se utilizaron 16 ratones hembra C57Bl6/J, de 8 a 12 semanas de edad y un peso corporal de 20 a 25 g. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar y fueron alimentados con comida y agua ad libitum. Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston. Los procedimientos abiertos descritos aquí se llevaron a cabo en condiciones estériles. 1. Modelo de xenoinjerto…

Representative Results

A un grupo de ratones hembra C57Bl6/J, de 8 a 12 semanas de edad, se les inyectaron células MC-38 en la fase logarítmica del crecimiento celular. Los xenoinjertos crecieron rápidamente entre la tercera y la cuarta semana después de la inyección18. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen promedio de 400mm3, los ratones fueron aleatorizados a los grupos control y experimental. El grupo control se sometió a ligadura de la VCI con sutura, mientras que los ratones experimentales …

Discussion

En un modelo singénico de cáncer de colon con xenoinjerto, observamos una mayor trombogenicidad y expresiones de marcadores de coagulación en el grupo experimental en comparación con el grupo control. Es importante destacar que la varianza en todos estos parámetros fue menor en el grupo experimental en comparación con el grupo control. La modificación consistió en la introducción de un clip vascular con un perfil de presión específico en el punto de confluencia de la VCI y la vena renal izquierda. El clip se c…

Materials

Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors – Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01