Tri unicellulaire de cellules souches mésenchymateuses immunophénotypées à partir de dents de lait exfoliées humaines

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence des cellules souches mésenchymateuses humaines à l’aide de la méthode de tri unicellulaire. Plus précisément, l’utilisation du tri unicellulaire permet d’atteindre une pureté de 99 % des cellules immunophénotypées d’une population hétérogène lorsqu’elle est associée à une approche multiparamétrique basée sur la cytométrie en flux.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’un organisme possèdent une capacité extraordinaire à se différencier en plusieurs lignées de cellules adultes dans le corps et sont connues pour leurs propriétés immunomodulatrices et anti-inflammatoires. L’utilisation de ces cellules souches est une aubaine pour le domaine de la biologie régénérative, mais en même temps, un fléau pour la médecine régénérative et la thérapeutique en raison des multiples ambiguïtés cellulaires qui leur sont associées. Ces ambiguïtés peuvent provenir de la diversité de la source de ces cellules souches et de leurs conditions de croissance in vitro , qui reflètent toutes deux leur hétérogénéité fonctionnelle.

Cela justifie des méthodologies pour fournir des populations purifiées et homogènes de CSM pour des applications thérapeutiques. Les progrès dans le domaine de la cytométrie en flux ont permis la détection de populations unicellulaires à l’aide d’une approche multiparamétrique. Ce protocole décrit un moyen d’identifier et de purifier les cellules souches des dents de lait exfoliées humaines (SHED) par le biais d’un tri unicellulaire assisté par fluorescence. L’expression simultanée de marqueurs de surface, à savoir l’isothiocyanate de fluorescéine CD90 (FITC), la protéine CD73-péridinine-chlorophylle (PerCP-Cy5.5), l’allophycocyanine CD105 (APC) et CD44-V450, a permis d’identifier les expresseurs positifs « brillants » des CSM à l’aide de la cytométrie en flux multiparamétrique. Cependant, une baisse significative a été observée dans les pourcentages de quadruples expresseurs de ces marqueurs positifs à partir du passage 7 jusqu’aux passages ultérieurs.

Les sous-populations immunophénotypées ont été triées en utilisant le mode de tri unicellulaire où seulement deux marqueurs positifs et un marqueur négatif constituaient les critères d’inclusion. Cette méthodologie a permis d’assurer la viabilité cellulaire des populations triées et de maintenir la prolifération cellulaire après le tri. L’application en aval d’un tel tri peut être utilisée pour évaluer la différenciation spécifique à la lignée pour les sous-populations fermées. Cette approche peut être appliquée à d’autres systèmes à cellule unique afin d’améliorer les conditions d’isolement et d’acquérir des informations sur les marqueurs de surface de plusieurs cellules.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent être considérées comme une source évolutive de cellules adaptées aux thérapies cellulaires et peuvent être considérées comme un système de référence en médecine régénérative. Ces cellules peuvent être isolées à partir d’une variété de sources dans le corps avec des origines tissulaires différentes¹. En fonction de leur tissu source, chaque type de CSM présente un comportement in vitro ambigu². Ceci est bien observé dans leurs propriétés morphologiques et fonctionnelles³. De nombreuses études ont montré une variation intra-clonale des dimensions, y compris la différenciation des tissus adultes, l’état génomique et l’architecture métabolique et cellulaire des CSM ^2,4.

L’immunophénotypage des cellules a été une application courante de la cytométrie en flux pour l’identification des cellules souches et cela a été utilisé par la Société internationale de thérapie cellulaire et génique (ISCT) en 2006 pour prescrire une liste de critères minimaux pour identifier les cellules comme des CSM. Il a déclaré qu’en plus de l’adhérence plastique et de la capacité de se différencier en trois lignées (ostéogène, chondrogénique et adipogénique) in vitro, ≥95% de la population cellulaire doit exprimer CD105, CD73, CD90, et ces cellules doivent manquer l’expression (≤2% positive) de CD34, CD45, CD11b, CD14 et HLA-DR, tel que mesuré par cytométrie en flux⁵. Bien que les CSM aient été définies par un ensemble de biomarqueurs selon les critères minimaux de l’ISCT, leurs propriétés immunitaires n’ont pas pu être comparées à ces biomarqueurs et il était nécessaire d’aller au-delà de ces critères pour faciliter les comparaisons entre études et les variations clonales^2.

Malgré les lignes directrices établies par l’ISCT, des recherches approfondies sur les CSM ont montré qu’il existe une hétérogénéité dans cette population, qui pourrait résulter d’une multitude de facteurs, principalement en raison de la nature omniprésente de l’hétérogénéité qui se produit entre les donneurs de CSM⁶, les sources tissulaires⁷, les cellules individuelles au sein d’une population clonale⁸ et les conditions de culture^{2,9, 10. Le Chapitre 10}. La caractérisation et la purification de ces cellules primaires à partir d’une variété de sources tissulaires afin d’assurer la qualité et le devenir cellulaire sont des étapes clés de leur production. La nécessité de comprendre les variations affichées au sein de la population nécessite une méthode efficace pour la résoudre en sous-populations qui peuvent être divisées et collectées séparément¹¹. Les analyses au niveau d’une seule cellule permettent de surmonter les défis de la variation de cellule à cellule, de réduire le bruit biologique résultant d’une population hétérogène et d’offrir la possibilité d’étudier et de caractériser les cellules rares¹².

En fonction de l’objectif et des paramètres choisis, plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour trier et enrichir les populations sélectionnées. Les techniques de tri cellulaire peuvent comprendre à la fois des méthodes de tri en vrac et des méthodes de tri à cellule unique. Alors que le tri en vrac peut enrichir les populations cibles grâce au tri cellulaire activé par le magnétisme (MACS)13, au fractionnement¹⁴ et à l’élutriation 15, le tri unicellulaire peut enrichir des populations plus homogènes au moyen du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)¹¹. Le tableau 1 présente une analyse comparative de chacune de ces méthodes, avec ses propres avantages et inconvénients.

Tableau 1 : Analyses comparatives de différentes techniques : MACS, Fractionnement, Elutriation et FACS mettant en évidence les différences dans leur principe et les avantages et inconvénients du choix d’une technique particulière par rapport à une autre. Abréviations : MACS = Tri des cellules activées par magnétisme ; FACS = Tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Depuis l’avènement de la technique, la cytométrie en flux unicellulaire a joué un rôle majeur dans le dénombrement¹⁶, la détection et la caractérisation d’une population cellulaire spécifique dans un échantillon hétérogène¹⁷. En 2006, Hewitt et al. ont jeté les bases d’une méthodologie de tri cellulaire automatisé pour améliorer l’isolement de pools homogènes de cellules souches embryonnaires humaines différenciées (CSEh)¹⁸. Le tri unicellulaire a enrichi la population de CSEh transduites par GFP, facilitant l’isolement de clones génétiquement modifiés, ce qui a ouvert une nouvelle dimension à la recherche clinique. Pour améliorer l’efficacité du tri, deux approches ont généralement été adoptées ; Soit les milieux de collecte des populations triées sont modifiés pour maintenir la viabilité et la prolifération des cellules post-triées¹⁹ , soit l’algorithme/logiciel de tri cellulaire est modifié de manière appropriée¹².

Grâce aux progrès de la technologie, les cytomètres en flux et les trieurs cellulaires commerciaux ont été en mesure d’aider à relever les défis qui ont été relevés lors du tri aseptique des populations de cellules fragiles et rares, en particulier des cellules souches d’origines différentes. L’un des principaux défis des biologistes des cellules souches a été l’isolement clonal de cellules souches pluripotentes humaines selon les protocoles de transfection requis dans les études d’édition de gènes¹⁹. Ce problème a été résolu en triant des cellules individuelles dans des plaques de 96 puits qui ont été recouvertes de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ainsi que de suppléments et d’inhibiteurs commerciaux de petites molécules ROCK. Cependant, les stratégies d’isolement cellulaire pourraient être largement affinées avec l’utilisation du tri par index, une caractéristique de l’algorithme de tri qui identifie l’immunophénotype des cellules individuelles triées¹². Cette modalité raffinée de tri unicellulaire a permis non seulement d’améliorer l’efficacité du tri des cellules souches, en particulier en ce qui concerne les populations rares de cellules souches hématopoïétiques, mais aussi de relier efficacement les clones unicellulaires à leurs tests fonctionnels en aval²⁰.

Cet article se concentre sur le tri unicellulaire de cellules souches immunophénotypées à partir de dents de lait exfoliées humaines (SHEDs) pour l’enrichissement de sous-populations afin d’étudier leurs capacités de différenciation fonctionnelle. À l’aide d’une combinaison de deux marqueurs MSC positifs, CD90 et CD73, et d’un marqueur hématopoïétique négatif CD45, les CSM ont été immunophénotypées et les exprimeurs faibles et nuls ont été identifiés. Sur la base de leur immunophénotype, les sous-populations ont été identifiées comme des CSM pures, des populations positives simples et des populations négatives doubles. Ils ont été triés à l’aide du mode de tri sur cellule unique afin d’obtenir des sous-populations pures et enrichies pour d’autres études fonctionnelles afin d’identifier si l’expression différentielle des marqueurs était un artefact des conditions de culture in vitro ou si elle avait également un effet sur les propriétés fonctionnelles. Les cellules qui n’étaient pas des exprimeurs homogènes des « marqueurs positifs des CSM » ont été triées pour étudier leurs propriétés fonctionnelles.

Protocol

Approbation éthique et consentement à participer : Des échantillons de pulpe dentaire à feuilles caduques exfoliés humains ont été reçus après avoir obtenu un consentement éclairé et une approbation éthique complète par le département buccal et maxillo-facial du Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), à Bangalore, conformément aux normes établies par le Comité d’approbation éthique de l’hôpital, SRGCDS. À la suite de quoi, l’isolement, la culture, l’entretien et l’application…

Representative Results

Les SHED ont été caractérisés à l’aide de tests d’immunofluorescence standard montrant l’expression de vimentine (filaments intermédiaires rouges de type III), de filaments d’actine (sondes de phalloïdine Alexa fluor 488) et de noyaux colorés au DAPI (Figure 1A). Pour estimer leurs capacités de prolifération et de formation de colonies, des tests standard de croissance cellulaire à court terme ont été effectués. Une augmentation de 14,3 fois du taux de prolifération en…

Discussion

Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative, parmi les sources postnatales, les CSM dérivées de tissus oraux ont suscité un vif intérêt en raison de leurs obligations éthiques minimales et de leur potentiel de différenciation multilignage notable²¹. Les cellules souches de la pulpe dentaire (CSPD) de la troisième molaire et des CSH touchées ont attiré le plus d’attention parmi les CSM dentaires pour leur potentiel thérapeutique dans les maladies ne…

Materials

Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	—
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	—
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	—	—	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	—-	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin – EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5