Одноклеточная сортировка иммунофенотипированных мезенхимальных стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека
Summary
Данный протокол описывает использование флуоресцентно-активированной сортировки мезенхимальных стволовых клеток человека методом одноклеточной сортировки. В частности, использование сортировки отдельных клеток позволяет достичь 99% чистоты иммунофенотипированных клеток из гетерогенной популяции в сочетании с многопараметрическим подходом, основанным на проточной цитометрии.
Abstract
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) организма обладают необычайной способностью дифференцироваться в несколько линий взрослых клеток в организме и известны своими иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами. Использование этих стволовых клеток является благом для области регенеративной биологии, но в то же время проклятием для регенеративной медицины и терапии из-за многочисленных клеточных двусмысленностей, связанных с ними. Эти неясности могут возникать из-за разнообразия в источнике этих стволовых клеток и условий их роста in vitro , что отражается на их функциональной гетерогенности.
Это обуславливает необходимость разработки методик получения очищенных, однородных популяций МСК для терапевтического применения. Достижения в области проточной цитометрии позволили обнаружить популяции одиночных клеток с использованием многопараметрического подхода. В этом протоколе описывается способ идентификации и очистки стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека (SHED) с помощью флуоресцентной сортировки отдельных клеток. Одновременная экспрессия поверхностных маркеров, а именно CD90-флуоресцеина изотиоцианата (FITC), CD73-перидинин-хлорофилла-белка (PerCP-Cy5.5), CD105-аллофикоцианина (APC) и CD44-V450, позволила идентифицировать «яркие» положительные экспрессоры МСК с помощью мультипараметрической проточной цитометрии. Тем не менее, наблюдалось значительное снижение процентного соотношения четырехкратных экспрессоров этих положительных маркеров, начиная с пассажа 7 и далее.
Иммунофенотипированные субпопуляции сортировали с использованием режима одноклеточной сортировки, где только два положительных и один отрицательный маркер составляли критерии включения. Эта методология обеспечивала жизнеспособность клеток отсортированных популяций и поддерживала пролиферацию клеток после сортировки. Нисходящее приложение для такой сортировки может быть использовано для оценки линейно-специфической дифференциации для закрытых субпопуляций. Этот подход может быть применен к другим одноклеточным системам для улучшения условий изоляции и получения информации о множественных маркерах клеточной поверхности.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) можно рассматривать как масштабируемый источник клеток, пригодных для клеточной терапии, и можно считать золотым стандартом системы в регенеративной медицине. Эти клетки могут быть выделены из различных источников в организме с различным тканевым происхождением1. В зависимости от исходной ткани каждый тип МСК демонстрирует неоднозначное поведение in vitro 2. Это хорошо видно по их морфологическим и функциональнымсвойствам 3. Многочисленные исследования показали внутриклональную изменчивость размеров, включая дифференцировку тканей взрослого человека, состояние генома, метаболическую и клеточную архитектуру МСК 2,4.
Иммунофенотипирование клеток является распространенным применением проточной цитометрии для идентификации стволовых клеток, и это было использовано Международным обществом клеточной и генной терапии (ISCT) в 2006 году для назначения списка минимальных критериев для идентификации клеток как МСК. Было установлено, что наряду с пластической приверженностью и способностью дифференцироваться на три линии (остеогенную, хондрогенную и адипогенную) in vitro, ≥95% клеточной популяции должны экспрессировать CD105, CD73, CD90, и эти клетки должны отсутствовать экспрессия (≤2% положительная) CD34, CD45, CD11b, CD14 и HLA-DR, измеренная с помощью проточной цитометрии5. Несмотря на то, что МСК определялись набором биомаркеров в соответствии с минимальными критериями ISCT, их иммунные свойства не могли быть сопоставлены с этими биомаркерами, и возникла необходимость в большем, чем эти критерии, чтобы облегчить количественнуюоценку перекрестных сравнений и клональных вариаций.
Несмотря на руководящие принципы, установленные ISCT, обширные исследования МСК показали, что в этой популяции существует гетерогенность, которая может возникнуть из-за множества факторов, в основном из-за повсеместного характера гетерогенности, возникающей между донорами МСК6, тканевыми источниками7, отдельными клетками в клональной популяции8 и условиями культивирования 2,9. 10. См. Характеристика и очистка этих первичных клеток из различных тканевых источников для обеспечения качества и судьбы клеток являются ключевыми этапами их производства. Необходимость понимания отображаемых вариаций среди генеральной совокупности требует эффективного метода разложения ее на субпопуляции, которые могут быть разделены и собраны по отдельности11. Анализ на уровне отдельных клеток помогает преодолеть проблемы, связанные с межклеточной изменчивостью, уменьшить биологический шум, возникающий в гетерогенной популяции, и дает возможность исследовать и характеризовать редкие клетки12.
В зависимости от цели и выбранных параметров можно использовать несколько методов сортировки и обогащения выбранных популяций. Методы сортировки клеток могут включать в себя как массовую сортировку, так и сортировку отдельных клеток. В то время как массовая сортировка может обогатить целевые популяции с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS)13, фракционирования14 и элютриации 15, сортировка отдельных клеток может обогатить более однородные популяции с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS)11. Сравнительный анализ каждого из этих методов со своим набором преимуществ и недостатков выделен в таблице 1.
Таблица 1: Сравнительный анализ различных методов: MACS, фракционирование, элютриация и FACS, подчеркивающий различия в их принципе, а также преимущества и недостатки выбора одного метода по сравнению с другим. Сокращения: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
С момента появления этого метода одноклеточная проточная цитометрия играла важную роль в перечислении16, обнаружении и характеристике специфической клеточной популяции в гетерогенной выборке17. В 2006 году Hewitt et al. заложили основу методологии автоматизированной сортировки клеток для улучшения выделения гомогенных пулов дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК)18. Одноклеточная сортировка обогатила популяцию трансдуцированных GFP чЭСК, способствуя выделению генетически модифицированных клонов, что открыло новое измерение в клинических исследованиях. Для повышения эффективности сортировки обычно используются два подхода; Либо среда для сбора отсортированных популяций модифицируется для поддержания жизнеспособности и пролиферации постсортированных клеток19 , либо алгоритм/программное обеспечение сортировки клеток соответствующим образом модифицируется12.
С развитием технологий коммерческие проточные цитометры и сортировщики клеток смогли помочь решить проблемы, которые были решены при асептической сортировке хрупких и редких клеточных популяций, особенно стволовых клеток различного происхождения. Одной из основных проблем, стоящих перед биологами стволовых клеток, является клональная изоляция плюрипотентных стволовых клеток человека в соответствии с протоколами трансфекции, требуемымив исследованиях редактирования генов. Эта проблема была решена путем сортировки отдельных клеток по 96-луночным планшетам, которые были покрыты мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) вместе с добавками и коммерческими низкомолекулярными ингибиторами ROCK. Тем не менее, стратегии выделения клеток могут быть в значительной степени усовершенствованы с использованием индексной сортировки, функции алгоритма сортировки, которая идентифицирует иммунофенотип отдельныхотсортированных клеток. Этот усовершенствованный метод сортировки отдельных клеток помог не только повысить эффективность сортировки стволовых клеток, особенно в отношении редких популяций гемопоэтических стволовых клеток, но и эффективно связать одноклеточные клоны с их последующими функциональными анализами20.
Данная работа посвящена одноклеточной сортировке иммунофенотипированных стволовых клеток из отслоившихся молочных зубов человека (SHEDs) для обогащения субпопуляций с целью изучения их функциональной дифференцировочной способности. Используя комбинацию двух МСК-положительных маркеров, CD90 и CD73, и отрицательного гемопоэтического маркера CD45, МСК были иммунофенотипированы и идентифицированы тусклые и нулевые экспрессоры. На основании иммунофенотипа субпопуляции были идентифицированы как чистые МСК, одиночные положительные и двойные отрицательные популяции. Они были отсортированы с использованием режима одноклеточной сортировки для получения чистых и обогащенных субпопуляций для дальнейших функциональных исследований, чтобы определить, является ли дифференциальная экспрессия маркеров артефактом условий культивирования in vitro или она также оказывает какое-либо влияние на функциональные свойства. Клетки, которые не были однородными экспрессорами «положительных маркеров МСК», были отсортированы для изучения их функциональных свойств.
Protocol
Representative Results
Discussion
В области тканевой инженерии и регенеративной медицины, среди постнатальных источников, МСК, полученные из пероральных тканей, вызвали глубокий интерес из-за их минимальных этических обязательств и значительного многолинейного дифференциального потенциала21. Стволовые ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Центр проточных ячеек в Центре передовых научных исследований им. Джавахарлала Неру (Бангалор, Индия) за использование основной установки проточной цитометрии. Криосекционирование гранульной культуры дифференцированных клеток проводили в референс-лаборатории Neuberg Anand, Бангалор, Индия. Эта работа была поддержана Академией высшего образования Манипала (MAHE), Индия. AG благодарит за поддержку стипендию доктора Т. М. А. Пая от MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
Referencias
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- . . FACSAria Fusion User’s Guide. , (2018).
