Ordinamento a singola cellula di cellule staminali mesenchimali immunofenotipizzate da denti decidui esfoliati umani
Summary
Questo protocollo descrive l’uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando il metodo di selezione a singola cellula. In particolare, l’uso del sorting a singola cellula può raggiungere una purezza del 99% delle cellule immunofenotipizzate da una popolazione eterogenea se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica.
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) di un organismo possiedono una straordinaria capacità di differenziarsi in più lignaggi di cellule adulte nel corpo e sono note per le loro proprietà immunomodulatorie e antinfiammatorie. L’uso di queste cellule staminali è una manna per il campo della biologia rigenerativa, ma allo stesso tempo, una rovina per la medicina rigenerativa e le terapie a causa delle molteplici ambiguità cellulari ad esse associate. Queste ambiguità possono derivare dalla diversità nella fonte di queste cellule staminali e dalle loro condizioni di crescita in vitro , che si riflettono entrambe sulla loro eterogeneità funzionale.
Ciò garantisce metodologie per fornire popolazioni purificate e omogenee di MSC per applicazioni terapeutiche. I progressi nel campo della citometria a flusso hanno permesso di rilevare popolazioni di singole cellule utilizzando un approccio multiparametrico. Questo protocollo delinea un modo per identificare e purificare le cellule staminali dai denti decidui esfoliati umani (SHED) attraverso la selezione di singole cellule assistita da fluorescenza. L’espressione simultanea di marcatori di superficie, vale a dire, CD90-isotiocianato di fluoresceina (FITC), CD73-peridinina-clorofilla-proteina (PerCP-Cy5.5), CD105-alloficocianina (APC) e CD44-V450, ha identificato gli espressiori positivi “luminosi” delle MSC utilizzando la citometria a flusso multiparametrica. Tuttavia, è stato osservato un calo significativo nelle percentuali di quadrupli espressiori di questi marcatori positivi dal passaggio 7 in poi ai passaggi successivi.
Le sottopopolazioni immunofenotipizzate sono state ordinate utilizzando la modalità di ordinamento a singola cellula in cui solo due marcatori positivi e uno negativo costituivano i criteri di inclusione. Questa metodologia ha garantito la vitalità cellulare delle popolazioni selezionate e ha mantenuto la proliferazione cellulare dopo lo smistamento. L’applicazione a valle per tale ordinamento può essere utilizzata per valutare la differenziazione specifica del lignaggio per le sottopopolazioni gated. Questo approccio può essere applicato ad altri sistemi a singola cellula per migliorare le condizioni di isolamento e per acquisire informazioni multiple sui marcatori di superficie cellulare.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono essere considerate una fonte scalabile di cellule adatte alle terapie cellulari e possono essere considerate un sistema gold standard nella medicina rigenerativa. Queste cellule possono essere isolate da una varietà di fonti nel corpo con diverse origini tissutali1. A seconda del tessuto di origine, ogni tipo di MSC mostra un comportamento in vitro ambiguo2. Ciò è ben osservato nelle loro proprietà morfologiche e funzionali3. Diversi studi hanno mostrato variazioni intraclonali nelle dimensioni, tra cui la differenziazione dei tessuti adulti, lo stato genomico e l’architettura metabolica e cellulare delle MSC 2,4.
L’immunofenotipizzazione delle cellule è stata un’applicazione comune della citometria a flusso per l’identificazione delle cellule staminali ed è stata utilizzata dall’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) nel 2006 per prescrivere un elenco di criteri minimi per identificare le cellule come MSC. Ha affermato che insieme all’aderenza plastica e alla capacità di differenziarsi in tre linee (osteogeniche, condrogeniche e adipogeniche) in vitro, il ≥95% della popolazione cellulare deve esprimere CD105, CD73, CD90 e queste cellule devono mancare dell’espressione (≤2% positiva) di CD34, CD45, CD11b, CD14 e HLA-DR, come misurato dalla citometria a flusso5. Sebbene le MSC fossero definite da una serie di biomarcatori secondo i criteri minimi dell’ISCT, le loro proprietà immunitarie non potevano essere confrontate con questi biomarcatori e c’era bisogno di ulteriori oltre questi criteri per rendere più facili da quantificare i confronti tra studi e le variazioni clonali2.
Nonostante le linee guida stabilite dall’ISCT, un’ampia ricerca sulle MSC ha dimostrato che esiste un’eterogeneità in questa popolazione, che potrebbe derivare da una moltitudine di fattori, principalmente a causa della natura ubiquitaria dell’eterogeneità che si verifica tra i donatori di MSC6, le fonti di tessuto7, le singole cellule all’interno di una popolazione clonale8 e le condizioni di coltura2,9, Ore 10. La caratterizzazione e la purificazione di queste cellule primarie da una varietà di fonti tissutali per garantire la qualità e il destino cellulare sono fasi chiave della loro produzione. La necessità di comprendere le variazioni mostrate all’interno della popolazione richiede un metodo efficiente per risolverle in sottopopolazioni che possono essere suddivise e raccolte separatamente11. Le analisi a livello di singola cellula aiutano a superare le sfide della variazione cellula-cellula, riducono il rumore biologico derivante da una popolazione eterogenea e offrono la possibilità di studiare e caratterizzare cellule rare12.
In base allo scopo e ai parametri scelti, possono essere impiegati diversi metodi per ordinare e arricchire le popolazioni selezionate. Le tecniche di selezione cellulare possono comprendere sia metodi di selezione alla rinfusa che metodi di selezione a singola cellula. Mentre lo smistamento di massa può arricchire le popolazioni bersaglio attraverso lo smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS)13, il frazionamento 14 e l’elutriazione 15, lo smistamento a cellula singola può arricchire popolazioni più omogenee per mezzo del selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)11. Un’analisi comparativa di ciascuno di questi metodi, con il proprio insieme di vantaggi e svantaggi, è evidenziata nella Tabella 1.
Tabella 1: Analisi comparative di diverse tecniche: MACS, Frazionamento, Elutriazione e FACS evidenziando le differenze nel loro principio e i vantaggi e gli svantaggi della scelta di una particolare tecnica rispetto ad un’altra. Abbreviazioni: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Dall’avvento della tecnica, la citometria a flusso a singola cellula ha svolto un ruolo importante nell’enumerazione16, nel rilevamento e nella caratterizzazione di una specifica popolazione cellulare in un campione eterogeneo17. Hewitt et al. nel 2006 hanno gettato le basi di una metodologia di selezione cellulare automatizzata per migliorare l’isolamento di pool omogenei di cellule staminali embrionali umane differenziate (hESCs)18. Lo smistamento a singola cellula ha arricchito la popolazione di hESC trasdotte con GFP facilitando l’isolamento di cloni geneticamente modificati, aprendo una nuova dimensione nella ricerca clinica. Per migliorare l’efficienza dello smistamento, sono stati generalmente adottati due approcci; O i terreni di raccolta delle popolazioni selezionate vengono modificati per sostenere la vitalità e la proliferazione delle cellule post-selezionate19 o l’algoritmo/software di selezione delle cellule viene opportunamente modificato12.
Con il progresso della tecnologia, i citometri a flusso commerciali e i selezionatori cellulari sono stati in grado di aiutare ad affrontare le sfide che sono state affrontate durante lo smistamento asettico di popolazioni cellulari fragili e rare, in particolare cellule staminali di origini diverse. Una delle principali sfide dei biologi delle cellule staminali è stata l’isolamento clonale di cellule staminali pluripotenti umane seguendo i protocolli di trasfezione richiesti negli studi di editing genetico19. Questo problema è stato affrontato ordinando singole cellule in piastre a 96 pozzetti rivestite con fibroblasti embrionali di topo (MEF) insieme a integratori e inibitori commerciali di piccole molecole ROCK. Tuttavia, le strategie di isolamento cellulare potrebbero essere in gran parte perfezionate con l’uso dell’index sorting, una caratteristica dell’algoritmo di sorting che identifica l’immunofenotipo delle singole cellule selezionate12. Questa raffinata modalità di selezione di singole cellule ha contribuito non solo a migliorare l’efficienza di selezione per le cellule staminali, in particolare per quanto riguarda le rare popolazioni di cellule staminali ematopoietiche, ma ha anche collegato in modo efficiente i cloni a singola cellula ai loro saggi funzionali a valle20.
Questo articolo si concentra sullo smistamento di singole cellule di cellule staminali immunofenotipizzate da denti decidui esfoliati umani (SHED) per l’arricchimento di sottopopolazioni per studiare le loro capacità di differenziazione funzionale. Utilizzando una combinazione di due marcatori MSC-positivi, CD90 e CD73, e di un marcatore ematopoietico negativo CD45, le MSC sono state immunofenotipizzate e sono stati identificati gli espressiori deboli e nulli. Sulla base del loro immunofenotipo le sottopopolazioni sono state identificate come MSC pure, popolazioni singole positive e doppie negative. Sono stati ordinati utilizzando la modalità di ordinamento a singola cellula per ottenere sottopopolazioni pure e arricchite per ulteriori studi funzionali per identificare se l’espressione differenziale dei marcatori fosse un artefatto delle condizioni di coltura in vitro o se avesse qualche effetto anche sulle proprietà funzionali. Le cellule che non erano espressioni omogenee dei “marcatori MSC positivi” sono state ordinate per studiare le loro proprietà funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel campo dell’ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa, tra le fonti postnatali, le MSC orali derivate da tessuto hanno suscitato un profondo interesse a causa dei loro obblighi etici minimi e del notevole potenziale di differenziazione multilignaggio21. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) del terzo molare impattato e le SHED hanno attirato la maggior parte dell’attenzione tra le MSC dentali per il loro potenziale terapeutico nelle malattie neurodegenerative e traumatiche<su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Flow Cell Facility del Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, India, per l’utilizzo della struttura centrale della citometria a flusso. La crio-sezione della coltura di pellet di cellule differenziate è stata eseguita presso il Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, India. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento intramurale dell’UC da parte della Manipal Academy of Higher Education (MAHE), in India. AG è grata per il supporto della borsa di studio Dr. T. M. A. Pai di MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
Referencias
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