JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Моделирование рассеянного склероза у лиц обоих полов: экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, индуцированный MOG35-55

Published: October 13, 2023
doi:
10.3791/65778
, , ,
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”,University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit,University of Camerino, 4Koelliker Hospital

Summary

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит является одной из наиболее широко используемых мышиных моделей рассеянного склероза. В текущем протоколе мышей C57BL/6J обоих полов иммунизируют пептидом гликопротеина олигодендроцита миелина, что приводит в основном к восходящему парезу хвоста и конечностей. Здесь мы обсудим протокол индукции и оценки ЭАЭ.

Abstract

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Он характеризуется разной распространенностью среди полов, поражая больше женщин, чем мужчин, и различными исходами, проявляя более агрессивные формы у мужчин, чем у женщин. Кроме того, рассеянный склероз весьма неоднороден по клиническим аспектам, рентгенологическим и патологическим признакам. Таким образом, необходимо воспользоваться экспериментальными животными моделями, позволяющими исследовать как можно больше аспектов патологии. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой одну из наиболее часто используемых моделей рассеянного склероза у мышей, моделирующую различные особенности заболевания, от активации иммунной системы до повреждения ЦНС. В данной работе описан протокол индукции ЭАЭ как у самцов, так и у самок мышей линии C57BL/6J с использованием иммунизации гликопротеинового пептида 35-55 миелина олигодендроцитов (MOG35-55), что приводит к развитию хронической формы заболевания. Мы также сообщаем об оценке ежедневной клинической оценки и двигательной активности этих мышей в течение 28 дней после иммунизации (28 точек на дюйм). Наконец, мы проиллюстрируем некоторые основные гистологические анализы на уровне ЦНС, уделяя особое внимание спинному мозгу как первичному месту повреждения, вызванного заболеванием.

Introduction

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Он показывает наличие периваскулярной инфильтрации воспалительных клеток, демиелинизации, потери аксонов и глиоза1. Его этиология остается неизвестной, а его клинические аспекты, рентгенологические и патологоанатомические особенности указывают на замечательную гетерогенность заболевания2.

Из-за его неизвестной этиологии и сложности в настоящее время ни одна животная модель не повторяет все клинические и рентгенологические признаки, отображаемые в MS 3,4 человека. Тем не менее, для изучения различных аспектов MS 3,4 используются различные животные модели. В этих моделях инициация заболевания, как правило, является чрезвычайно искусственной, а временные рамки появления клинических признаков у людей и мышей различны. Например, у человека патофизиологические процессы, лежащие в основе заболевания, остаются незамеченными в течение многих лет до появления клинических проявлений. И наоборот, экспериментаторы могут обнаружить симптомы у животных моделей в течение нескольких недель или даже дней после индукции рассеянного склероза4.

Три основные животные модели дают признаки демиелинизации, характерные для рассеянного склероза: те, которые индуцируются вирусом (например, вирус мышиного энцефаломиелита Тейлера), те, которые индуцируются токсическими агентами (например, купризоном, лизолецитином) и различные варианты экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ)5. Каждая модель помогает изучить некоторые специфические аспекты заболевания, но ни одна из них не воспроизводит все особенности рассеянного склероза6. Таким образом, крайне важно выбрать правильную модель с учетом конкретных экспериментальных потребностей и научных вопросов, которые необходимо решить.

Благодаря процедурам иммунизации против антигенов, полученных из миелина, ЭАЭ индуцируется путем запуска аутоиммунного ответа на компоненты ЦНС у восприимчивых мышей. Взаимодействие широкого спектра иммунопатологических и невропатологических механизмов обусловливает развитие основных патологических признаков рассеянного склероза (т.е. воспаления, демиелинизации, потери аксонов и глиоза) у иммунизированных мышей 7,8. У мышей начинают проявляться клинические симптомы примерно на второй неделе после иммунизации и, как правило, наблюдается восходящий паралич от хвоста к конечностям и передним конечностям. Клиническая оценка (т.е. количественная оценка накопления дефицита, связанного с заболеванием) обычно оценивается по 5-балльной шкале7.

Активная иммунизация белком или пептидом или пассивный перенос энцефалитогенных Т-клеток может быть использована для индуцирования ЭАЭ у мышей с различным генетическим фоном (например, SJL/J, C57BL/6 и мышей без ожирения и диабета (NOD). Миелиновый протеолипидный белок (PLP), основной белок миелина (MBP) и гликопротеин олигодендроцитов миелина (MOG) являются примерами собственных белков ЦНС, из которых обычно образуются иммуногены. В частности, у мышей линии SJL/J, иммунизированных иммунодоминантным эпитопом PLP (PLP139−151), развивается рецидивирующе-ремиттирующее (RR) течение болезни, в то время как у мышей линии C57BL/6J, иммунизированных иммунодоминантным пептидом MOG35-55 , отмечается хронический характерЭАЭ 1. Несмотря на некоторые ограничения, такие как предоставление очень малой информации о прогрессировании рассеянного склероза, роли В-клеток в заболевании, механизмах выемки наизнанку или трудностях в изучении ремиелинизации, модели ЭАЭ внесли огромный вклад в понимание аутоиммунных и нейровоспалительных процессов, расширив знания в области рассеянного склероза и, таким образом, позволив разработать новые терапевтические подходы кэтому заболеванию. 6.

В настоящей работе мы сосредоточились на особой форме активного ЭАЭ, миелиновом олигодендроцитарном гликопротеиновом пептиде 35-55 (MOG35-55)-индуцированной форме 9,10,11,12. MOG35-55-индуцированная ЭАЭ моделирует хроническую форму рассеянного склероза. После иммунизации мыши проходят бессимптомную фазу в течение первой недели после иммунизации, затем болезнь обычно возникает в течение второй недели после иммунизации, в то время как между третьей и четвертой неделями после иммунизации болезнь переходит в хроническую форму, без возможности полного выздоровления от накопленного дефицита 7,8,13. Интересно, что в большинстве исследований, представленных в литературе14, не наблюдается различий между мужчинами и женщинами в заболеваемости, начале, течении или прогрессировании заболевания, даже если в меньшем количестве исследований заболевание сравнивается у мужчин и женщин.

Напротив, у людей эти параметры, как известно, имеют сильный половой диморфизм2. Рассеянный склероз чаще поражает женщин, чем мужчин; Однако у мужчин, как правило, развивается более агрессивная формазаболевания2. Эти данные свидетельствуют о существенной, а также сложной роли гонадных гормонов15; Тем не менее, роль и механизм действия половых гормонов при патологии остаются неясными. Более того, данные, полученные на животных моделях, подтверждают идею о том, что как эстрогены, так и андрогены оказывают положительное влияние на различные тракты патологии в зависимости от пола16,17.

Некоторые исследования также предполагают нейропротекторное, промиелинизирующее и противовоспалительное действие прогестерона18 , и, хотя доказательств у пациентов с рассеянным склерозом мало18, нейроактивные стероиды (т.е. de novo синтезированные нервной системой стероиды, такие как прегненолон, тетрагидропрогестерон и дигидропрогестерон) также могут влиять на течение патологии19. В совокупности эти данные подтверждают идею о том, что половые гормоны, вырабатываемые как периферически, так и внутри ЦНС, играют важную и специфичную для пола роль в возникновении и прогрессировании заболевания. Поэтому в настоящей работе мы призываем к сбору раздельных данных как от самцов, так и от самок животных.

С гистопатологической точки зрения белое вещество спинного мозга служит основным местом повреждения ЦНС в этой модели, которая характеризуется мультифокальными, сливающимися областями мононуклеарной воспалительной инфильтрации и демиелинизации8. Таким образом, описывая этот протокол индукции MOG35-55-индуцированной ЭАЭ у мышей C57BL/6J, мы примем во внимание исход заболевания у обоих полов и предоставим некоторые гистопатологические сведения о спинном мозге.

Protocol

Уход за животными и обращение с ними в данной работе осуществлялось в соответствии с Директивой Совета Европейского Союза от 22сентября 2010 г. (2010/63/UE); все процедуры, о которых сообщалось в настоящем исследовании, были одобрены Министерством здравоохранения Италии (407/2018-PR) и Этическ…

Representative Results

Наблюдение за ЭАЭ после иммунизацииЭто было оценено так, как описано ниже. Масса тела и потребление пищиДвухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) (пол и время как независимые переменные) показывают снижение МТ ЭАЭ животных обоих полов, особенно в теч…

Discussion

Описанный нами протокол ЭАЭ, индуцированный MOG35-55, привел к развитию хронической формы рассеянного склероза у мышей C57BL/6J 7,8,13. В этих репрезентативных результатах мы сообщили, что у животных обоего пола, прошедших процедуру иммуни…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – проектом MIUR Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 и 2023-2027 для Департамента неврологии Риты Леви Монтальчини; Фонд Кавальери-Оттоленги, Орбассано, Италия. BB был стипендиатом INFRA-P, регион Пьемонт (n.378-35) (2022-2023) и PRIN 2020 – 20203AMKTW. Мы благодарим Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) за поддержку. Плата за публикацию была поддержана любезным пожертвованием Distretto Rotaract 2031 и, в частности, Rotaract Club Torino Nord-Est. Мы благодарим Элейн Миллер за корректуру нашей рукописи.

Materials

18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Keywords: Multiple SclerosisExperimental Autoimmune EncephalomyelitisEAE ModelSex DifferencesMOG35-55Clinical AssessmentNeuroinflammationAutoimmune DiseaseCentral Nervous System
check_url/es/65778?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image