Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55
Summary
La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.
Abstract
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Se caracteriza por una prevalencia diferente en los sexos, afectando más a las mujeres que a los hombres, y diferentes resultados, mostrando formas más agresivas en los hombres que en las mujeres. Además, la EM es muy heterogénea en cuanto a aspectos clínicos, características radiológicas y patológicas. Por lo tanto, es necesario aprovechar los modelos animales experimentales que permiten investigar la mayor cantidad posible de aspectos de la patología. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) representa uno de los modelos de EM más utilizados en ratones, modelando diferentes características de la enfermedad, desde la activación del sistema inmune hasta el daño en el SNC. En este trabajo describimos un protocolo para la inducción de EAE en ratones C57BL/6J machos y hembras mediante inmunización con el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55), que conduce al desarrollo de una forma crónica de la enfermedad. También informamos de la evaluación de la puntuación clínica diaria y el rendimiento motor de estos ratones durante 28 días después de la inmunización (28 dpi). Por último, ilustramos algunos análisis histológicos básicos a nivel del SNC, centrándonos en la médula espinal como el sitio primario de daño inducido por la enfermedad.
Introduction
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC). Muestra la presencia de infiltración perivascular de células inflamatorias, desmielinización, pérdida axonal y gliosis1. Su etiología sigue siendo desconocida y sus aspectos clínicos, radiográficos y patológicos sugieren una notable heterogeneidad en la enfermedad2.
Debido a su etiología y complejidad desconocidas, en la actualidad, ningún modelo animal recapitula todas las características clínicas y radiológicas mostradas en la EM humana 3,4. Sin embargo, se emplean varios modelos animales para estudiar diferentes aspectos de la EM 3,4. En estos modelos, el inicio de la enfermedad suele ser extremadamente artificial, y el período de tiempo de aparición de los signos clínicos es diferente entre humanos y ratones. Por ejemplo, en los seres humanos, los procesos fisiopatológicos subyacentes a la enfermedad no se detectan durante años antes de la aparición de las manifestaciones clínicas. Por el contrario, los experimentadores pueden detectar síntomas en modelos animales dentro de las semanas o incluso días posteriores a la inducción de la EM4.
Tres modelos animales básicos producen las características de desmielinización que son características de la EM: las que son inducidas por virus (p. ej., el virus de la encefalomielitis murina de Theiler), las que son inducidas por agentes tóxicos (p. ej., cuprizona, lisolecitina) y las diferentes variantes de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)5. Cada modelo ayuda a estudiar algunas facetas específicas de la enfermedad, pero ninguno replica todas las características de la EM6. Por lo tanto, es fundamental elegir el modelo correcto teniendo en cuenta las necesidades experimentales específicas y las cuestiones científicas que se abordarán.
Gracias a los procedimientos de inmunización contra antígenos derivados de mielina, la EAE es inducida mediante el desencadenamiento de una respuesta autoinmune a los componentes del SNC en ratones susceptibles. La interacción entre una amplia gama de mecanismos inmunopatológicos y neuropatológicos provoca el desarrollo de los principales rasgos patológicos de la EM (es decir, inflamación, desmielinización, pérdida axonal y gliosis) en los ratones inmunizados 7,8. Los ratones comienzan a mostrar síntomas clínicos alrededor de la segunda semana después de la inmunización y, por lo general, muestran una parálisis ascendente desde la cola hasta la extremidad y la extremidad anterior. La puntuación clínica (es decir, la cuantificación de la acumulación de déficits relacionados con la enfermedad) se evalúa generalmente mediante una escala de 5 puntos7.
La inmunización activa con proteínas o péptidos o la transferencia pasiva de células T encefalitógenas se puede utilizar para inducir EAE en ratones con diferentes antecedentes genéticos (p. ej., SJL/J, C57BL/6 y ratones no obesos-diabéticos (NOD)). La proteína proteolípida de mielina (PLP), la proteína básica de mielina (MBP) y la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) son ejemplos de proteínas del SNC a partir de las cuales generalmente se producen inmunógenos. En particular, los ratones SJL/J inmunizados con el epítopo inmunodominante de PLP (PLP139-151) desarrollan un curso de enfermedad remitente-recurrente (RR), mientras que los ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido inmunodominante MOG35-55 muestran EAE de naturaleza crónica1. A pesar de algunas limitaciones, como la escasa información sobre la progresión de la EM, el papel de las células B en la enfermedad, los mecanismos de adentro hacia afuera o las dificultades en el estudio de la remielinización, los modelos EAE han contribuido enormemente a la comprensión de los procesos autoinmunes y neuroinflamatorios, aumentando el conocimiento en el campo de la EM y permitiendo así el desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas para esta enfermedad4. 6.
En el presente trabajo, nos centramos en una forma particular de EAE activa,la forma 9,10,11,12 inducida por el péptido glicoproteico de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). La EAE inducida por MOG35-55 modela una forma crónica de EM. Después de la inmunización, los ratones pasan por una fase asintomática dentro de la primera semana después de la inmunización, luego la enfermedad suele surgir durante la segunda semana después de la inmunización, mientras que entre la tercera y cuarta semana después de la inmunización, la enfermedad se vuelve crónica, sin posibilidad de recuperación completa de los déficits acumulados 7,8,13. Curiosamente, en la mayoría de los estudios presentes en la literatura no se observan diferencias entre hombres y mujeres en cuanto a la incidencia, el inicio de la enfermedad, el curso o la progresión14, aunque son pocos los estudios que comparan la enfermedad en hombres y mujeres.
Por el contrario, en los seres humanos, se sabe que estos parámetros son fuertemente dimórficossexualmente 2. La esclerosis múltiple afecta más a las mujeres que a los hombres; Sin embargo, los hombres generalmente desarrollan una forma más agresiva de la enfermedad2. Esta evidencia ha sugerido un papel esencial, así como complejo, de las hormonas gonadales15; Sin embargo, el papel y el mecanismo de acción de las hormonas sexuales en la patología siguen sin estar claros. Además, los datos de modelos animales apoyan la idea de que tanto los estrógenos como los andrógenos ejercen efectos positivos en diferentes tractos de la patología de forma específica para cada sexo16,17.
Algunos estudios también sugieren efectos neuroprotectores, promielinizantes y antiinflamatorios de la progesterona18 y, aunque la evidencia en pacientes con EM es escasa18, los esteroides neuroactivos (es decir, esteroides sintetizados de novo por el sistema nervioso, como la pregnenolona, la tetrahidroprogesterona y la dihidroprogesterona) también podrían afectar el curso patológico19. En conjunto, estos datos apoyan la idea de que las hormonas sexuales producidas tanto periféricamente como dentro del SNC tienen un papel importante y específico del sexo en la aparición y progresión de la enfermedad. Por lo tanto, en el presente trabajo, instamos a la recopilación de datos separados de los animales machos y hembras.
Desde el punto de vista histopatológico, la sustancia blanca de la médula espinal sirve como el sitio principal de lesión del SNC en este modelo, que se caracteriza por regiones multifocales y confluentes de infiltración inflamatoria mononuclear y desmielinización8. Por lo tanto, al describir este protocolo para la inducción de EAE inducida por MOG35-55 en ratones C57BL/6J, tendremos en cuenta el resultado de la enfermedad en los dos sexos y proporcionaremos algunos conocimientos histopatológicos sobre la médula espinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo EAE inducido por MOG35-55 que describimos condujo al desarrollo de una forma crónica de EM en ratones C57BL/6J 7,8,13. En estos resultados representativos, reportamos que los animales de ambos sexos que se sometieron al procedimiento de inmunización desarrollaron una forma crónica de la enfermedad (es decir, no se recuperan completamente después del inicio de la enfermedad, acumulan déficits y mantie…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido apoyado por el Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR proyecto Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 y 2023-2027 al Departamento de Neurociencia Rita Levi Montalcini; Fundación Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Italia. BB fue becario de INFRA-P, Región de Piamonte (n.378-35) (2022-2023) y PRIN 2020 – 20203AMKTW. Agradecemos a la Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) por el apoyo. Las cuotas de publicación han sido financiadas por la amable donación del Distretto Rotaract 2031 y, en particular, del Club Rotaract Torino Nord-Est. Agradecemos a Elaine Miller por la revisión de nuestro manuscrito.
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
Referencias
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
- Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
- Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
- Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
- Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
- Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
- McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
- Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
- Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
- Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
- Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
- Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
- Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
- vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
- Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
- Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
- Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
- Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
- Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
- Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
- Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
- Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
- Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
