Monitoraggio della fibrinolisi di coaguli di sangue intero formati ad ansa di Chandler sotto flusso di taglio in un modello di trombolisi in vitro
Summary
I test di trombolisi in vitro hanno spesso faticato a replicare le condizioni in vivo, sia nel trombo modello da digerire che nell’ambiente in cui si verifica la trombolisi. In questo articolo, esploriamo come l’accoppiamento del ciclo di Chandler e del saggio di fibrinolisi a flusso fluorimetrico in tempo reale (RT-FluFF) viene utilizzato per il monitoraggio della lisi del coagulo ex-vivo ad alta fedeltà.
Abstract
Il tromboembolismo e le complicanze correlate sono una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo e sono stati sviluppati vari test per testare l’efficacia dei farmaci trombolitici sia in vitro che in vivo. C’è una crescente domanda di modelli di coaguli in vitro fisiologicamente più rilevanti per lo sviluppo di farmaci a causa della complessità e del costo associati ai modelli animali, oltre alla loro spesso mancanza di traducibilità nella fisiologia umana. Il flusso, la pressione e la velocità di taglio sono caratteristiche importanti del sistema circolatorio, con coaguli che si formano sotto il flusso che mostrano caratteristiche morfologiche e digestive diverse rispetto ai coaguli formati staticamente. Questi fattori sono spesso non rappresentati nei saggi convenzionali in vitro di digestione dei coaguli, che possono avere implicazioni farmacologiche che influiscono sui tassi di successo della traduzione dei farmaci.
Il test Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) è stato sviluppato come piattaforma di test della trombolisi ad alta fedeltà che utilizza coaguli marcati in fluorescenza formati sotto flusso di taglio, che vengono poi digeriti utilizzando plasma circolante in presenza o assenza di agenti farmaceutici fibrinolitici. La modifica delle velocità di flusso sia delle fasi di formazione del coagulo che di digestione del coagulo consente al sistema di imitare le condizioni arteriose, polmonari e venose in configurazioni sperimentali molto diverse. Le misurazioni possono essere effettuate in modo continuo utilizzando un fluorimetro in linea o prendendo punti temporali discreti, nonché una misurazione convenzionale della massa del coagulo del punto finale. Il test RT-FluFF è un sistema flessibile che consente il monitoraggio in tempo reale della digestione del coagulo in condizioni di flusso che rappresentano in modo più accurato le condizioni fisiologiche in vivo, pur mantenendo il controllo e la riproducibilità di un sistema di test in vitro.
Introduction
Le malattie che derivano fondamentalmente da eziologie tromboemboliche rappresentano una delle principali fonti di morbilità e mortalità nella società odierna. Le manifestazioni della patogenesi trombo-embolica includono, ma non sono limitate a, infarti del miocardio, ictus ischemici, trombosi venose profonde ed emboli polmonari1. Un’enorme quantità di ricerca in corso, che abbraccia più discipline, ruota attorno allo sviluppo di metodi sicuri ed efficaci per affrontare la trombosi patogena. Le variazioni nelle manifestazioni arteriose e venose della trombosi e le diverse sedi anatomiche hanno portato allo sviluppo di diversi approcci terapeutici. Tuttavia, il trattamento acuto si basa generalmente sull’uso della trombolisi farmacologica tramite attivatori del plasminogeno con il potenziale di trombectomia meccanica in determinate circostanze cliniche2.
Lo sviluppo di nuove strategie di trattamento farmacologico si basa fondamentalmente sia su modelli animali in vivo che su modelli di digestione in vitro per i test preclinici 3,4. I modelli in vivo beneficiano naturalmente della loro capacità di catturare la complessa interazione di vari parametri fisiologici sull’efficacia del trattamento, che includono l’eliminazione degli agenti farmaceutici e le interazioni cellulari con i farmaci. Tuttavia, questa stessa complessità rende spesso tali modelli piuttosto costosi e introduce ulteriori problemi quando si tenta di isolare le farmacodinamiche/cinetiche sottostanti negli animali che differiscono significativamente dalla fisiologia umana. Lo sviluppo di modelli in vitro ha contribuito facilitando un ambiente di test distillato in cui lo sviluppo e lo screening dei farmaci possono essere eseguiti, ma spesso manca della fedeltà necessaria per ricapitolare lo stato della malattia oggetto di studio.
I protocolli in vitro comunemente presenti per testare nuovi trombolitici si basano sull’utilizzo di coaguli formati e lisati in condizioni statiche, in cui la massa residua del coagulo funge da endpoint primario 5,6. Sfortunatamente, tali tecniche non tengono conto degli aspetti meccanici della lisi del coagulo, come il flusso turbolento e le cadute di pressione trans-trombo che possono alterare significativamente la farmacodinamica dei farmaci in esame. Inoltre, i coaguli formati in condizioni statiche contengono una microarchitettura che differisce dai coaguli fisiologici. È stato dimostrato che la presenza di taglio durante la formazione del coagulo influisce in modo riproducibile sulle caratteristiche del coagulo risultanti, come l’attivazione piastrinica e la reticolazione della fibrina. I coaguli prodotti sotto flusso di taglio mostrano una complessa eterogeneità dalla punta alla coda che è assente nei coaguli formati staticamente 7,8. Tali deviazioni dall’architettura fisiologica del coagulo possono influire su un’importante caratterizzazione dello sviluppo di farmaci che include la penetrazione del farmaco all’interno di un trombo e la successiva efficienza della lisi9.
Per affrontare alcune di queste limitazioni associate all’uso di modelli statici di coagulazione/lisi del coagulo, l’adozione del ciclo di Chandler sia per la formazione del coagulo che per la lisi del coagulo in presenza di taglio ha visto una rinascita10. Sebbene tali sistemi consentano una migliore rappresentazione della dinamica del flusso e generino coaguli con un’architettura fisiologicamente più rilevante rispetto ai saggi relativamente statici, le loro condizioni di flusso semplificate rappresentano ancora una deviazione dalle condizioni fisiologiche. Infine, sono stati intrapresi anche approcci microfluidici grazie alla loro facilità di imaging e ai modelli di flusso uniformi; tuttavia, rimangono una significativa rimozione dalle condizioni fisiologiche attese all’interno dei vasi più grandi principalmente colpiti nella maggior parte dei disturbi tromboembolici clinicamente rilevanti11,12.
Tenendo presente la discussione di cui sopra, abbiamo sviluppato un modello di trombolisi in vitro ad alta fedeltà per lo screening preclinico dei farmaci trombolitici. Il modello mira ad affrontare alcune delle attuali insidie descritte sopra nell’ambito dello screening di nuove terapie trombolitiche ed è stato convalidato per la riproducibilità e la sensibilità a concentrazioni variabili dell’attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Il sistema qui descritto offre flussi di taglio fisiologici utilizzando una pompa peristaltica, uno smorzatore di pressione, un serbatoio riscaldato, due sensori di pressione, un fluorimetro in linea e un analogo del coagulo formato da taglio ad anello Chandler etichettato in fluorescenza per facilitare il monitoraggio in tempo reale della fibrinolisi13. Nel complesso, l’intero sistema è chiamato Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolilysis Assay (RT-FluFF Assay)14 e questo manoscritto discuterà le complessità dell’impostazione e dell’esecuzione di test di successo in questo modello di trombolisi in vitro ad alta fedeltà.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formazione e marcatura del coagulo
È stato dimostrato che l’ansa di Chandler fornisce un mezzo semplice ed efficace per generare in modo riproducibile coaguli che imitano i trombi 16 in vivo. Parametri di messa a punto come le dimensioni del tubo, la velocità di rotazione, il diametro del tamburo e il tempo di coagulazione consentono la rapida generazione di coaguli in diverse condizioni di taglio in grado di catturare caratteristiche architettoniche apprezzate in un…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Heart, Lung, And Blood Institute del National Institutes of Health con il numero di premio R01HL167877. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
Referencias
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