Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi
Summary
İn vitro tromboliz deneyleri, ister model trombüsün sindirildiği ortamda ister trombolizin meydana geldiği ortamda olsun, in vivo koşulları tekrarlamak için sıklıkla mücadele etmiştir. Burada, Chandler döngüsü ve Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testinin (RT-FluFF) birleştirilmesinin yüksek kaliteli, ex-vivo, pıhtı lizisi izleme için nasıl kullanıldığını keşfediyoruz.
Abstract
Tromboembolizm ve ilişkili komplikasyonlar dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir ve trombolitik ilaç etkinliğini hem in vitro hem de in vivo olarak test etmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Hayvan modelleriyle ilişkili karmaşıklık ve maliyetin yanı sıra genellikle insan fizyolojisine çevrilebilirlik eksikliği nedeniyle, ilaç geliştirme için fizyolojik olarak daha ilgili in vitro pıhtı modellerine yönelik artan bir talep vardır. Akış, basınç ve kayma hızı dolaşım sisteminin önemli özellikleridir ve akış altında oluşan pıhtılar, statik olarak oluşan pıhtılardan farklı morfoloji ve sindirim özellikleri gösterir. Bu faktörler genellikle geleneksel in vitro pıhtı sindirim testlerinde temsil edilmez ve bu da ilaç translasyonel başarı oranlarını etkileyen farmakolojik etkilere sahip olabilir.
Real-T ime Griporometrik Fdüşük Fibrinoliz (RT-FluFF) testi, kesme akışı altında oluşan floresan etiketli pıhtıları kullanan ve daha sonra fibrinolitik farmasötik ajanların varlığında veya yokluğunda dolaşımdaki plazma kullanılarak sindirilen yüksek kaliteli bir tromboliz test platformu olarak geliştirilmiştir. Hem pıhtı oluşumunun hem de pıhtı sindirim adımlarının akış hızlarını değiştirmek, sistemin çok çeşitli deney düzeneklerinde arteriyel, pulmoner ve venöz koşulları taklit etmesine olanak tanır. Ölçümler, bir in-line florometre kullanılarak veya ayrı zaman noktaları alınarak ve ayrıca geleneksel bir son nokta pıhtı kütlesi ölçümü kullanılarak sürekli olarak alınabilir. RT-FluFF testi, bir in vitro test sisteminin kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini korurken, in vivo fizyolojik koşulları daha doğru bir şekilde temsil eden akış koşulları altında pıhtı sindiriminin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin veren esnek bir sistemdir.
Introduction
Temelde tromboembolik etiyolojilerden kaynaklanan hastalıklar günümüz toplumunda önemli bir morbidite ve mortalite kaynağı oluşturmaktadır. Tromboembolik patogenezin belirtileri arasında, bunlarla sınırlı olmamak üzere, miyokard enfarktüsü, iskemik inmeler, derin ven trombozları ve pulmoner emboli1 bulunur. Birden fazla disiplini kapsayan muazzam miktarda devam eden araştırma, patojenik trombozla başa çıkmak için güvenli ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi etrafında dönmektedir. Trombozun arteriyel ve venöz bulgularındaki farklılıklar ve değişen anatomik lokalizasyonlar farklı tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, akut tedavi genellikle belirli klinik koşullar altında mekanik trombektomi potansiyeli olan plazminojen aktivatörleri yoluyla farmakolojik tromboliz kullanımına dayanır2.
Yeni farmakolojik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi temel olarak hem in-vivo hayvan modellerine hem de klinik öncesi testler için in-vitro sindirim modellerine dayanmaktadır 3,4. İn vivo modeller, farmasötik ajanların temizlenmesinin yanı sıra ilaçlarla hücresel etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik parametrelerin tedavi etkinliği üzerindeki karmaşık etkileşimini yakalama yeteneklerinden doğal olarak yararlanır. Bununla birlikte, bu aynı karmaşıklık genellikle bu tür modelleri oldukça maliyetli hale getirir ve hayvanlarda insan fizyolojisinden önemli ölçüde farklı olan altta yatan farmako-dinamikleri / kinetiği izole etmeye çalışırken ek sorunlar ortaya çıkarır. İn vitro modellerin geliştirilmesi, ilaç geliştirme ve taramanın gerçekleştirilebildiği, ancak genellikle incelenen hastalık durumunu özetlemek için gerekli aslına uygun olmayan damıtılmış bir test ortamının kolaylaştırılmasına yardımcı olmuştur.
Yeni trombolitiklerin test edilmesi için yaygın olarak bulunan in vitro protokoller, statik koşullar altında oluşan ve parçalanan pıhtıların kullanımına dayanır, bu sayede artık pıhtı kütlesi birincil son nokta olarak hizmet eder 5,6. Ne yazık ki, bu tür teknikler, test ilaçlarının farmakodinamiğini önemli ölçüde değiştirebilen türbülanslı akış ve trans-trombüs basınç düşüşleri gibi pıhtı lizizinin mekanik yönlerini hesaba katmamaktadır. Ek olarak, statik koşullar altında oluşan pıhtılar, fizyolojik pıhtılardan farklı mikro mimari içerir. Pıhtı oluşumu sırasında kaymanın varlığının, trombosit aktivasyonu ve fibrin çapraz bağlanması gibi ortaya çıkan pıhtı özelliklerini etkilediği tekrarlanabilir bir şekilde gösterilmiştir. Kesme akışı altında üretilen pıhtılar, statik olarak oluşturulmuş pıhtılarda bulunmayan uçtan kuyruğa karmaşık heterojenlik sergiler 7,8. Fizyolojik pıhtı mimarisinden bu tür sapmalar, bir trombüs içinde ilaç penetrasyonunu ve müteakip lizis etkinliğini içeren önemli ilaç geliştirme karakterizasyonunu etkileyebilir9.
Statik pıhtılaşma/pıhtı parçalama modellerinin kullanımıyla ilişkili bu sınırlamalardan bazılarını ele almak için, kesme varlığında hem pıhtı oluşumu hem de pıhtı lizisi için Chandler döngüsünün benimsenmesi bir canlanma gördü10. Bu tür sistemler, akış dinamiklerinin daha iyi bir temsiline izin vermesine ve nispeten statik tahlillere kıyasla fizyolojik olarak daha ilgili mimariye sahip pıhtılar oluşturmasına rağmen, basitleştirilmiş akış koşulları hala fizyolojik koşullardan bir sapmayı temsil eder. Son olarak, görüntüleme kolaylığı ve tekdüze akış modelleri nedeniyle mikroakışkan yaklaşımlar da gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, klinik olarak anlamlı tromboembolik bozuklukların çoğunda birincil olarak etkilenen daha büyük damarlarda beklenen fizyolojik koşullardan önemli bir uzaklaştırma olmaya devam etmektedirler11,12.
Yukarıdaki tartışmayı göz önünde bulundurarak, klinik öncesi trombolitik ilaç taraması için yüksek kaliteli, in vitro tromboliz modeli geliştirdik. Model, yeni trombolitik tedavi taraması alanında yukarıda ayrıntıları verilen mevcut tuzaklardan bazılarını ele almayı amaçlamaktadır ve değişen doku plazminojen aktivatörü (tPA) konsantrasyonlarında tekrarlanabilirlik ve duyarlılık açısından doğrulanmıştır. Burada açıklanan sistem, fibrinoliz13’ün gerçek zamanlı takibini kolaylaştırmak için bir peristaltik pompa, bir basınç sönümleyici, ısıtılmış bir rezervuar, iki basınç sensörü, bir hat içi florometre ve floresan etiketli bir Chandler döngü kesme biçimli pıhtı analogu kullanan fizyolojik kesme akışları sunar. Birlikte ele alındığında, genel sistem Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi (RT-FluFF Testi)14 olarak adlandırılır ve bu el yazması, bu yüksek kaliteli in vitro tromboliz modelinde tahlillerin başarılı bir şekilde kurulması ve yürütülmesinin inceliklerini tartışacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pıhtı oluşumu ve etiketleme
Chandler döngüsünün, in-vivo trombüsleritaklit eden pıhtıları tekrarlanabilir şekilde oluşturmak için kolay ve etkili bir yol sağladığı gösterilmiştir 16. Boru boyutu, dönme hızları, tambur çapı ve pıhtılaşma süresi gibi ince ayar parametreleri, hem arteriyel hem de venöz kaynakları taklit eden bir dizi trombusta takdir edilen mimari özellikleri yakalayabilen farklı kesme koşulları altında hızlı pıhtı …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından R01HL167877 Numaralı Ödül altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
Referencias
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14 (2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833 (2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
