Отслеживание фибринолиза цельных кровяных сгустков, образованных петлей Чандлера, под действием сдвигового потока в модели тромболизиса in vitro
Summary
Анализы тромболизиса in vitro часто изо всех сил пытались воспроизвести условия in vivo, будь то в модельном тромбе, который переваривается, или в среде, в которой происходит тромболизис. В данной работе мы исследуем, как сочетание петли Чандлера и флуориметрического анализа проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF) используется для высокоточного мониторинга лизиса сгустков ex-vivo.
Abstract
Тромбоэмболия и связанные с ней осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, и были разработаны различные анализы для проверки эффективности тромболитических препаратов как in vitro , так и in vivo. Существует растущий спрос на более физиологически релевантные модели тромбов in vitro для разработки лекарств из-за сложности и стоимости, связанных с животными моделями, в дополнение к их частой непереносимости на физиологию человека. Поток, давление и скорость сдвига являются важными характеристиками системы кровообращения, при этом сгустки, которые образуются под действием потока, имеют другую морфологию и характеристики пищеварения, чем статически образующиеся сгустки. Эти факторы часто не представлены в обычных анализах переваривания сгустков in vitro , что может иметь фармакологические последствия, влияющие на показатели успеха трансляции препарата.
Орометрическийанализ Real-T ime Flu Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) был разработан в качестве высокоточной платформы для тестирования тромболизиса, в которой используются флуоресцентно помеченные сгустки, образующиеся под действием поперечного потока, которые затем расщепляются с использованием циркулирующей плазмы в присутствии или без фибринолитических фармацевтических агентов. Изменение скорости потока как на этапе образования тромба, так и на этапах его расщепления позволяет системе имитировать артериальные, легочные и венозные состояния в самых разнообразных экспериментальных установках. Измерения могут проводиться непрерывно с помощью встроенного флуориметра или путем измерения дискретных временных точек, а также обычного измерения массы конечного сгустка. Анализ RT-FluFF представляет собой гибкую систему, которая позволяет отслеживать расщепление сгустков в режиме реального времени в условиях потока, которые более точно отражают физиологические условия in vivo, сохраняя при этом контроль и воспроизводимость системы тестирования in vitro.
Introduction
Заболевания, в основном обусловленные тромбоэмболической этиологией, представляют собой основной источник заболеваемости и смертности в современном обществе. Проявления тромбоэмболического патогенеза включают, но не ограничиваются ими, инфаркт миокарда, ишемические инсульты, тромбозы глубоких вен и легочную эмболию1. Огромное количество текущих исследований, охватывающих несколько дисциплин, вращается вокруг разработки безопасных и эффективных методов борьбы с патогенным тромбозом. Вариации артериальных и венозных проявлений тромбоза и различные анатомические локализации привели к разработке различных подходов к лечению. Тем не менее, острое лечение, как правило, основано на использовании фармакологического тромболизиса с помощью активаторов плазминогена с потенциалом механической тромбэктомии при определенных клинических обстоятельствах2.
Разработка новых стратегий фармакологического лечения в основном опирается как на животные модели in vivo, так и на модели экстракорпорального разложения для доклинических испытаний 3,4. Модели in-vivo, естественно, выигрывают от своей способности фиксировать сложное взаимодействие различных физиологических параметров на эффективность лечения, включая клиренс фармацевтических агентов, а также клеточные взаимодействия с лекарствами. Тем не менее, эта же сложность часто делает такие модели довольно дорогостоящими и создает дополнительные проблемы при попытке изолировать лежащую в основе фармакодинамику/кинетику у животных, которые значительно отличаются от физиологии человека. Разработка моделей in vitro помогла в этом, облегчив условия дистиллированного тестирования, в которых можно проводить разработку лекарств и скрининг, но часто им не хватает точности, необходимой для повторения изучаемого состояния заболевания.
Обычно встречающиеся протоколы in vitro для тестирования новых тромболитиков основаны на использовании тромбов, сформированных и лизированных в статических условиях, при этом остаточная масса тромба служит первичной конечной точкой 5,6. К сожалению, такие методы не учитывают механические аспекты лизиса тромба, такие как турбулентный поток и перепады давления через тромбы, которые могут значительно изменить фармакодинамику испытуемых препаратов. Кроме того, сгустки, образующиеся в статических условиях, содержат микроархитектуру, отличную от физиологических сгустков. Было показано, что присутствие сдвига во время образования тромба воспроизводимо влияет на результирующие характеристики тромба, такие как активация тромбоцитов и сшивание фибрина. Сгустки, образующиеся при сдвиговом потоке, демонстрируют сложную неоднородность от кончика до хвоста, которая отсутствует в статически сформированных сгустках 7,8. Такие отклонения от физиологической архитектуры тромба могут повлиять на важную характеристику разработки лекарственного средства, которая включает проникновение препарата в тромб и последующую эффективность лизиса9.
Для устранения некоторых из этих ограничений, связанных с использованием статических моделей свертывания/лизиса сгустков, наблюдается возрождение петли Чандлера как для образования сгустков, так и для лизиса сгустков в присутствии сдвига. Несмотря на то, что такие системы позволяют лучше представить динамику потока и генерировать сгустки с более физиологически релевантной архитектурой по сравнению с относительно статическими анализами, их упрощенные условия потока все же представляют собой отклонение от физиологических условий. Наконец, микрофлюидные подходы также были использованы из-за их простоты визуализации и равномерных схем течения; Тем не менее, они остаются значительным удалением от физиологических состояний, ожидаемых в крупных сосудах, в первую очередь пораженных при наиболее клинически значимых тромбоэмболических заболеваниях11,12.
Учитывая вышеизложенное, мы разработали высокоточную модель тромболизиса in vitro для доклинического скрининга тромболитических препаратов. Модель направлена на устранение некоторых из описанных выше ловушек в области скрининга новой тромболитической терапии и была проверена на воспроизводимость и чувствительность при различных концентрациях активатора тканевого плазминогена (tPA). Описанная здесь система обеспечивает физиологические сдвиговые потоки с использованием перистальтического насоса, демпфера давления, нагреваемого резервуара, двух датчиков давления, встроенного флуориметра и флуоресцентно помеченного аналога сгустка Чандлера, формируемого при сдвиге, для облегчения отслеживания фибринолиза13 в режиме реального времени. В совокупности вся система называется Флуориметрический анализ проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF Assay)14 , и в этой рукописи будут обсуждаться тонкости успешной постановки и проведения анализов в этой высокоточной модели тромболизиса in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Образование сгустков и маркировка
Было продемонстрировано, что петля Чандлера является простым и эффективным средством воспроизводимого образования тромбов, имитирующих тромбы 16 in vivo. Точная настройка таких параметров, как размер трубки, скорость вращени…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения в рамках премии No R01HL167877. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
Referencias
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14 (2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833 (2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
