Fabricage van myogene Engineered Tissue constructen
Summary
Hier tonen we de fabricage van op basis van collageen, weefsel constructen die het skelet myoblasten. Deze 3-D ontworpen constructies kunnen worden gebruikt om weefsels te vervangen of repareren<em> In vivo</em>. Voor ons doel, hebben we deze als een atrioventriculaire elektrische leiding voor de reparatie van complete hartblok<sup> [1]</sup>.
Abstract
Ondanks het feit dat elektronische pacemakers zijn levensreddende medische hulpmiddelen, hun prestaties op lange termijn bij pediatrische patiënten kan problematisch zijn als gevolg van de beperkingen die worden opgelegd door kleine een kind grootte en hun onvermijdelijke groei. Bijgevolg is er een werkelijke behoefte aan innovatieve therapieën die specifiek ontworpen voor pediatrische patiënten met hartritmestoornissen. Wij stellen voor dat een geleidende biologisch alternatief dat bestaat uit een op basis van collageen matrix die autologously-afgeleide cellen beter kunnen aanpassen aan de groei, verminderen de noodzaak voor terugkerende operaties, en sterk verbeteren van de kwaliteit van leven voor deze patiënten. In de huidige studie beschrijven we een procedure voor het opnemen van de primaire skelet myoblast cel culturen binnen een hydrogel matrix van de mode een chirurgisch-implanteerbare weefsel te bouwen dat zal dienen als een elektrische leiding tussen de bovenste en onderste kamers van het hart. Uiteindelijk verwachten we gebruik van dit type van gemanipuleerde weefsel aan atrioventriculaire elektrische geleiding te herstellen in kinderen met een compleet hartblok. In het licht van dat, we isoleren myoblasten van de skeletspieren van neonatale Lewis ratten en plaat ze op laminine-coated weefselkweek gerechten met een aangepaste versie van vastgestelde protocollen<sup> [2, 3]</sup>. Na een tot twee dagen, zijn gekweekte cellen verzameld en vermengd met antibiotica, type 1 collageen, Matrigel ™ en NaHCO<sub> 3</sub>. Het resultaat is een viskeuze, uniforme oplossing die kan worden gegoten in een mal van bijna elke vorm en grootte<sup> [1, 4, 5]</sup>. Voor onze weefsels constructies maken we gebruik van type 1 collageen geïsoleerd uit foetaal lam huid met behulp van standaardprocedures<sup> [6]</sup>. Zodra het weefsel heeft gestolde bij 37 ° C, cultuur media wordt zorgvuldig toegevoegd aan de plaat tot het construct is ondergedompeld. De kunstmatige weefsel wordt dan toegestaan om verder te condenseren door uitdroging voor nog 2 dagen, op welk punt is nu klaar voor<em> In vitro</em> Beoordeling of chirurgische-implantatie.
Protocol
Discussion
De mallen waarin het weefsel te bouwen zullen worden geworpen kan worden gemaakt in elke gewenste vorm en grootte, maar er moet ten minste twee punten van bevestiging. Anders, de matrix en cellen vormen een bolvormige structuur en de cellen sterven. In het huidige protocol beschrijven we het gebruik van een polyester mesh voor dit doel, maar we hebben ook met succes gebruikt roestvrij staal gaas. Uiteraard zal grotere vormen vereisen meer cellen en een groter volume van de andere ingrediënten. Bij het maken van de mall…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (HL068915, HL088206), een nieuwe onderzoeker Award van de Thrasher Research Fund, en bijdragen aan het hartgeleiding Fonds op Children's Hospital Boston.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Silicone tubing | VWR | 60985-724 | ||
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | ||
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | ||
| Laminin | Sigma | L2020 | ||
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma | N6908 | ||
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | ||
| Dispase-2 | Roche | 10295825001 | ||
| Collagenase 2 | Worthington | 46H8863 | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G5071 | ||
| 150 mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353025 | ||
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | ||
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | ||
| 7.5% NaHCO3 | Gibco | 25080-094 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| 50 mL Conical Vial | BD Falcon | 352098 | ||
| 15 mL Conical Vial | BD Falcon | 352099 | ||
| 0.2 μm filter | Nalgene | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
