Fabbricazione di miogenici Costrutti di ingegneria tessutale
Summary
In questo studio dimostriamo realizzazione di costruzioni a base di collagene dei tessuti, contenenti mioblasti scheletrici. Questi costrutti ingegnerizzati in 3-D possono essere usati per sostituire o riparare i tessuti<em> In vivo</em>. Per i nostri scopi, abbiamo progettato questi come un canale atrioventricolare elettrico per la riparazione di blocco cardiaco completo<sup> [1]</sup>.
Abstract
Nonostante il fatto che i pacemaker elettronici sono salvavita dispositivi medici, le loro prestazioni a lungo termine nei pazienti pediatrici può essere problematico a causa delle restrizioni imposte dalle ridotte dimensioni di un bambino e la loro crescita inevitabile. Di conseguenza, vi è una reale necessità di terapie innovative progettate specificamente per i pazienti pediatrici con disturbi del ritmo cardiaco. Proponiamo che una alternativa biologica conduttivo costituito da una matrice a base di collagene contenenti autologously cellule derivate potrebbe adattarsi meglio alla crescita, ridurre la necessità di interventi chirurgici ricorrenti, e migliorare notevolmente la qualità della vita per questi pazienti. Nel presente studio, si descrive una procedura per l'integrazione primaria mioblasti scheletrici colture di cellule in una matrice idrogel di moda un costrutto tessuto chirurgicamente impiantabili che servirà come un condotto elettrico tra le camere superiori e inferiori del cuore. In ultima analisi, possiamo anticipare utilizza questo tipo di ingegneria tessutale per ripristinare atrioventricolare di conduzione elettrica nei bambini con arresto cardiaco completo. In considerazione di questo, abbiamo isolare mioblasti dai muscoli scheletrici di ratti neonati Lewis e la piastra di loro su piatti tessuto laminina rivestite cultura utilizzando una versione modificata di protocolli stabiliti<sup> [2, 3]</sup>. Dopo uno o due giorni, cellule coltivate vengono raccolti e mescolati con gli antibiotici, il collagene di tipo 1, Matrigel ™ e NaHCO<sub> 3</sub>. Il risultato è una viscosa, soluzione uniforme che può essere gettato in uno stampo di quasi ogni forma e dimensione<sup> [1, 4, 5]</sup>. Per il nostro tessuto costruisce, ci avvaliamo di collagene di tipo 1 isolato dalla pelle di agnello del feto utilizzando le procedure standard<sup> [6]</sup>. Una volta che il tessuto è solidificato a 37 ° C, la cultura dei media è attentamente aggiunto alla piastra fino a quando il costrutto è sommerso. L'ingegneria tessutale è poi permesso di condensare ulteriormente attraverso la disidratazione per altri 2 giorni, a quel punto è pronto per<em> In vitro</em> Valutazione o chirurgico-impianto.
Protocol
Discussion
Le forme in cui il costrutto tessuto sarà cast può essere effettuato in qualsiasi forma e dimensione, ma ci deve essere almeno due punti di attacco. In caso contrario, la matrice e le cellule formano una struttura sferica e le cellule muoiono. Nel presente protocollo, si descrive l'utilizzo di una maglia in poliestere per questo scopo, ma abbiamo anche utilizzato con successo in rete in acciaio inox. Ovviamente, più grandi stampi richiederà più celle e un volume maggiore di altri ingredienti. Quando si effettua…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915; HL088206), un premio Ricercatore Nuovo dal Fondo di ricerca Thrasher, e contributi al fondo di conduzione cardiaca presso il Children Hospital di Boston.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Silicone tubing | VWR | 60985-724 | ||
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | ||
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | ||
| Laminin | Sigma | L2020 | ||
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma | N6908 | ||
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | ||
| Dispase-2 | Roche | 10295825001 | ||
| Collagenase 2 | Worthington | 46H8863 | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G5071 | ||
| 150 mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353025 | ||
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | ||
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | ||
| 7.5% NaHCO3 | Gibco | 25080-094 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| 50 mL Conical Vial | BD Falcon | 352098 | ||
| 15 mL Conical Vial | BD Falcon | 352099 | ||
| 0.2 μm filter | Nalgene | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
